血液病原聯(lián)合檢測(cè)基因芯片技術(shù)的研究.pdf

1、為保證臨床用血安全,血液在經(jīng)采集進(jìn)入血庫(kù)前要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)。人類獲得性免疫缺陷綜合癥、乙型肝炎、丙型肝炎以及梅毒作為血液篩查的常規(guī)項(xiàng)目,通常要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的初篩和復(fù)篩,使用兩種不同廠家的試劑由不同的檢測(cè)人員進(jìn)行兩次檢測(cè),且兩次結(jié)果均為陰性的血液標(biāo)本方可入庫(kù)。引起這四種疾病的病原體HIV、HBV、HCV以及梅毒螺旋體若進(jìn)入血液對(duì)人體健康危害極大,成為嚴(yán)重威脅輸血安全的潛在因素,因此如何有效控制和預(yù)防血源性傳染病在人群中的擴(kuò)散和傳播至關(guān)重要,而嚴(yán)

2、格篩查血源及血制品中的病原體則成為最為關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。
　　 目前針對(duì)上述病原感染的檢測(cè)手段主要依賴于免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法。免疫學(xué)診斷的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),這種方法不能檢測(cè)出處于窗口期及新近感染病毒的血標(biāo)本,造成漏檢率高。以核酸檢測(cè)技術(shù)為代表的分子生物學(xué)檢測(cè)方法雖然可縮短窗口期,但費(fèi)時(shí)耗力,檢測(cè)效率較低。
　　 基因芯片技術(shù)具有高通量、早期診斷以及自動(dòng)化的特性,能對(duì)多病原體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),利用該技術(shù)進(jìn)

3、行大規(guī)模初篩不僅可以顯著提高采血機(jī)構(gòu)檢測(cè)效率,而且對(duì)于控制傳染性疾病的傳播提供了重要保障。然而基因芯片的臨床應(yīng)用尤其是多病原的聯(lián)合檢測(cè)仍然面臨著一些問(wèn)題,其中包括芯片的質(zhì)量控制以及不同核酸(DNA、RNA)樣品的標(biāo)記。本研究針對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題進(jìn)行了如下探索,研究?jī)?nèi)容分為三部分。
　　 第一部分提出了一種新型寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)與有效的芯片質(zhì)控方法。新型探針設(shè)計(jì)方法介紹如下:在前期實(shí)驗(yàn)篩選得到的HIV探針中,本研究選取其中兩條,取其核心

4、部分50mer或60mer,在其兩端或一端分別加上一段10mer的堿基序列(相當(dāng)于一個(gè)通用序列標(biāo)簽,universal sequence tag,UST,與第二套通用引物部分互補(bǔ)的序列),設(shè)計(jì)出18條長(zhǎng)度在60mer或70mer的寡核苷酸探針,同時(shí)將不加連接臂的該兩條探針作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。UST可分為三種方式,分別為通用引物近5’端互補(bǔ)序列、中間互補(bǔ)序列以及近3’端互補(bǔ)序列。將探針打印于環(huán)氧基包被的芯片表面后,以Cy5標(biāo)記的通用引物(

5、Cy5-universalprimer,Cy5-UP)與該芯片雜交,篩選出熒光信號(hào)值高于1000、信噪比(signal-to-noiseratio,SNR)高于4的探針(滿足條件之一設(shè)為陽(yáng)性探針)。從芯片的雜交結(jié)果中初步篩選了五條探針(1、8、9、10、12號(hào))。
　　 進(jìn)一步將經(jīng)過(guò)篩選的5條探針重新打印,19號(hào)探針作為陰性對(duì)照,點(diǎn)樣液作為空白對(duì)照,分別以熒光標(biāo)記的通用引物(Cy5-UP)與隨機(jī)引物(Cy5-randomprim

6、er,Cy5-RP,9mer),與芯片雜交,以比較兩種質(zhì)控方法的檢測(cè)效果。將通用引物與隨機(jī)引物分別倍比稀釋至20μmol/L、2μmol/L,與0.2μmol/L,與2×雜交緩沖液混合點(diǎn)樣。雜交洗脫經(jīng)掃描后分析其熒光信號(hào)值及SNR可知,當(dāng)采用20μmol/L與2μmol/L的通用引物雜交時(shí),通用引物雜交的熒光信號(hào)值明顯強(qiáng)于隨機(jī)引物；當(dāng)濃度降至0.2μmol/L時(shí),隨機(jī)引物雜交基本無(wú)熒光信號(hào)值,而通用引物雜交的8號(hào)探針仍顯示出較強(qiáng)信號(hào),說(shuō)

7、明了利用通用引物來(lái)檢測(cè)芯片質(zhì)量的優(yōu)越性；同時(shí)篩選出了信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定的最佳UST為8號(hào)探針,它的連接方式是在探針的兩端各加上10mer的近5’端互補(bǔ)序列(UST序列為:5'-TATGACTCAG-3'),且該序列與5'端相隔兩個(gè)堿基；其次信號(hào)也較強(qiáng)的1號(hào)探針(UST序列與8號(hào)探針相同、只連接在靶基因探針5’端)可作為備選方案。考慮探針合成的成本與檢測(cè)效率,本研究以1號(hào)探針UST設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 為了驗(yàn)證這種新型探針的穩(wěn)

8、定性,以HBV基因?yàn)檠芯繉?duì)象,設(shè)計(jì)了13條寡核苷酸探針,將1號(hào)UST連接在了所設(shè)計(jì)的13條HBV探針的5’端。采用Cy5-UP與探針雜交,結(jié)果顯示1號(hào)UST標(biāo)簽與通用引物的雜交結(jié)果信號(hào)穩(wěn)定,熒光信號(hào)值較強(qiáng),可作為下一步聯(lián)合檢測(cè)寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)及質(zhì)量控制的選擇方案。
　　 由此可知,本部分設(shè)計(jì)了一種新型寡核苷酸探針,并建立了一種與之匹配、有效的芯片質(zhì)控方法。
　　 本研究第二部分探索了通用引物聯(lián)合標(biāo)記法(universal

9、 primer labeling,UPL)在DNA樣品標(biāo)記中的應(yīng)用。芯片雜交檢測(cè)過(guò)程中,樣品的熒光標(biāo)記是極其關(guān)鍵的一個(gè)步驟,快速有效的標(biāo)記技術(shù)將對(duì)基因芯片技術(shù)的應(yīng)用和推廣產(chǎn)生重要的實(shí)用價(jià)值。
　　 限制性顯示(restriction display,RD)熒光標(biāo)記技術(shù)是本實(shí)驗(yàn)室核酸標(biāo)記的一項(xiàng)專利技術(shù)。RD技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)是一項(xiàng)有效的全基因組熒光標(biāo)記方法,尤其適合于DNA樣品的標(biāo)記。采用RD-PCR技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增,是通過(guò)

10、對(duì)限制性酶切片段連接接頭后,以針對(duì)接頭設(shè)計(jì)的通用引物,實(shí)現(xiàn)樣品中全基因組的擴(kuò)增標(biāo)記。由于標(biāo)記過(guò)程中涉及酶切、加接頭、一至兩輪擴(kuò)增等步驟,操作較繁瑣,臨床應(yīng)用時(shí)可能不易被技術(shù)人員掌握,因此,需要進(jìn)一步探索新的優(yōu)化方法。
　　 通用引物聯(lián)合標(biāo)記法UPL是本實(shí)驗(yàn)室的另一項(xiàng)專利核酸標(biāo)記技術(shù),該技術(shù)采用一種通用的隨機(jī)引物USN2(在第一套通用引物US的末端加上兩個(gè)隨機(jī)堿基),在RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后加入U(xiǎn)SN2作為引物進(jìn)行10個(gè)

11、循環(huán)的第一輪PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后反應(yīng)混合物中則出現(xiàn)5’端含有通用引物序列US的雙鏈DNA片段,接著采用熒光標(biāo)記的通用引物(Cy3-universal sequence,Cy3-US)對(duì)這些 DNA片段進(jìn)行第二輪擴(kuò)增標(biāo)記。由于其具有高效、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),UPL方法尤其適合RNA樣品的標(biāo)記,在RNA病原檢測(cè)芯片中應(yīng)用較多。由于聯(lián)合檢測(cè)的血液病原體中同時(shí)存在DNA病原體與RNA病原體,因此,聯(lián)合標(biāo)記DNA及RNA樣品成為本研究需要解決的問(wèn)題所在。本

12、部分以RD熒光標(biāo)記技術(shù)作為對(duì)比,探索UPL技術(shù)在DNA樣品中的標(biāo)記效率,為進(jìn)一步聯(lián)合標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。
　　 首先以梅毒螺旋體的TP和POLA兩個(gè)基因片段作為研究對(duì)象,利用前期實(shí)驗(yàn)篩選得到的11條探針制備芯片,對(duì)DNA片段分別進(jìn)行UPL與RD標(biāo)記后,與該芯片進(jìn)行雜交。結(jié)果表明熒光信號(hào)值均強(qiáng)而穩(wěn)定,計(jì)算探針真陽(yáng)性率可知二者標(biāo)記效果無(wú)明顯差別。由此得出,使用UPL技術(shù)對(duì)DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增可行且高效,同時(shí)由于UPL技術(shù)中省去了酶切及加接頭

13、等步驟,操作流程更為簡(jiǎn)單方便,為后續(xù)UPL的推廣使用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 由于采用UPL對(duì)DNA樣品進(jìn)行標(biāo)記后,擴(kuò)增出大小在200bp～1000bp的若干DNA片段。為進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增片段與探針之間是否具有對(duì)應(yīng)性(即優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增探針匹配的靶基因),選取TP基因的第二輪UPL擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)行分子克隆及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),挑出100個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果表明DNA片段大小與擴(kuò)增標(biāo)記時(shí)一致。USN2末端的堿基與Sau3AI的GATC酶切位點(diǎn)相同

14、,而該位點(diǎn)在堿基序列中的存在規(guī)律理論上是每256個(gè)堿基存在一個(gè)該位點(diǎn),因此進(jìn)行擴(kuò)增后的DNA片段基本位于此范圍內(nèi),鑒定結(jié)果與預(yù)期相符合。由此可知,使用UPL技術(shù)對(duì)微量的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增高效可行,且操作步驟簡(jiǎn)單,可用于后續(xù)病原體的微量擴(kuò)增。
　　 在建立新型探針及質(zhì)控方法、UPL聯(lián)合標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上,本研究第三部分制備血液病原聯(lián)合檢測(cè)芯片,并應(yīng)用于小樣本的臨床樣品檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證上述聯(lián)合檢測(cè)芯片技術(shù)的可靠性。
　　 首先

15、將第一部分設(shè)計(jì)好的13條HBV探針打印于環(huán)氧基玻片表面,使用UPL標(biāo)記HBV的質(zhì)粒Bj58及血清樣品。標(biāo)記后的樣品分別與芯片進(jìn)行雜交,篩選出陽(yáng)性探針6條,用于后續(xù)聯(lián)合檢測(cè)。其次,將UST標(biāo)簽的新型探針方式用于HIV、HCV及梅毒探針的設(shè)計(jì),其中,梅毒探針采用第二部分篩選得到的探針6條,HIV和HCV探針分別采用本實(shí)驗(yàn)前期臨床實(shí)驗(yàn)篩選確定的探針,各6條。將上述探針加上陽(yáng)性、陰性對(duì)照打印于同一張芯片制備聯(lián)合檢測(cè)芯片。采集經(jīng)臨床確診的乙肝、丙

16、肝及梅毒血清樣品,正常人血清樣品用作陰性對(duì)照,以及模擬HIV感染的質(zhì)粒樣品。分別提取其DNA或RNA,經(jīng)UPL方法進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記后,與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)。小樣本的臨床樣品結(jié)果初步顯示,制備的聯(lián)合檢測(cè)芯片質(zhì)量可靠,UPL標(biāo)記方法有效,四種病原體的基因檢測(cè)均較敏感,特異性高。
　　 綜上所述,本研究建立了一種新型寡核苷酸探針及有效的芯片質(zhì)控方法,探索了通用引物聯(lián)合標(biāo)記法在DNA樣品標(biāo)記中的應(yīng)用,最終制備了血液四種病原聯(lián)合檢測(cè)的寡核苷酸芯