Dnase-I純化結(jié)合堿性裂解法提取混合斑精子DNA.pdf

1、性犯罪案件中最常見(jiàn)的生物學(xué)檢材為精液與陰道分泌液組成的混合斑。在法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)鑒定中常需要進(jìn)行混合斑的DNA檢驗(yàn),確定男性精子的個(gè)體來(lái)源從而偵破案件。精子DNA的提取是混合斑DNA檢驗(yàn)的關(guān)鍵,提取DNA的量的多少和純度的優(yōu)劣直接決定著檢驗(yàn)成功與否。目前主要采用差異裂解細(xì)胞的方法分離混合斑中的精子和陰道上皮細(xì)胞,然后通過(guò)有機(jī)法、Chelex-100法等分別提取陰道上皮細(xì)胞和精子細(xì)胞兩種成分的DNA進(jìn)行分型鑒定。但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,DNA提取率

2、低,而且差異裂解的效果受到檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)水平以及實(shí)際案件檢材的具體條件的影響,最終得到的STR分型圖譜常表現(xiàn)為混和斑,結(jié)果難于解釋,極大降低了混合斑檢驗(yàn)鑒定結(jié)論的證據(jù)價(jià)值。
　　 針對(duì)上述問(wèn)題,本研究擬利用脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase-Ⅰ)消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或寡脫氧核苷酸的特性,將混合斑中女性DNA分解除去,再結(jié)合堿性裂解法消化精子,從而提取混合斑中精子DNA。
　　 首先從廣州血液中心購(gòu)買(mǎi)20份精液檢

3、材,按梯度加生理鹽水稀釋?zhuān)环謩e與20份口腔拭子混勻,制作成20份人工混合斑檢材。按照文獻(xiàn)方法應(yīng)用 DNase-Ⅰ酶等裂解上述檢材中的口腔上皮細(xì)胞,建立DNase-Ⅰ純化結(jié)合堿性裂解法提取混合斑精子DNA的實(shí)驗(yàn)流程。另將上述分離后的精子細(xì)胞應(yīng)用堿性裂解法提取DNA,進(jìn)行SIR分型檢測(cè)后統(tǒng)計(jì)分析比較。重復(fù)上述操作,直至應(yīng)用最終調(diào)整的體系方法提取的混合斑精子 DNA,經(jīng)STR分型檢驗(yàn)成功的樣本比例達(dá)到100％,并確定最終建立的分離上皮細(xì)胞和精

4、子細(xì)胞方法體系和精子DNA提取方法和體系。
　　 從公安系統(tǒng)DNA實(shí)驗(yàn)室日常實(shí)際檢案中收集79份含精子細(xì)胞的陰道拭子(P30金標(biāo)試紙條實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性)。分別用DNase-Ⅰ純化結(jié)合堿性裂解法和差異裂解法提取混合斑中精子DNA,采用ldentifiler試劑盒進(jìn)行15個(gè)STR基因座擴(kuò)增,電泳檢測(cè)在3130xl遺傳分析儀上進(jìn)行,應(yīng)用Genemapper3.2軟件進(jìn)行STR分型檢測(cè)。對(duì)于分型圖譜中正確分型的基因座達(dá)到15個(gè)、各等位基因峰高

5、于150RFU的樣本判定為檢驗(yàn)成功的樣本。統(tǒng)計(jì)應(yīng)用DNase-Ⅰ純化結(jié)合堿性裂解法和差異裂解法提取混合斑精子DNA經(jīng)STR分型檢驗(yàn)成功的樣本數(shù)量、提取時(shí)間與費(fèi)用,并做平行比較;應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)兩種提取方法的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)計(jì)數(shù)資料的 x2檢驗(yàn)(McNemar)。對(duì)所建立的分離上皮細(xì)胞和精子細(xì)胞方法體系、精子DNA提取方法和體系準(zhǔn)確性、重復(fù)性、提取效率等進(jìn)行評(píng)估。應(yīng)用DNase-Ⅰ純化結(jié)合堿性裂解法提取精子DNA,64例檢材分型

6、成功；應(yīng)用差異裂解法提取精子DNA,57例檢材分型成功；兩種方法比較結(jié)果存在顯著性差異(P=0.039),Dnase-1純化結(jié)合堿性裂解法提取的精子 DNA的STR分型成功率更高,成本低廉。
　　 結(jié)論:DNase-Ⅰ純化結(jié)合堿性裂解法提取混合斑中精子 DNA與目前普遍采取的差異裂解法和其它改良方法相比,具有效果好、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、成本低、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于處理刑事案件中各類(lèi)混合斑精子DNA的提取,提高檢驗(yàn)成功