鐵調(diào)素調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、背景：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成是心腦血管疾病的共同病理學基礎(chǔ)。大量證據(jù)表明，鐵在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在人及新西蘭大白兔的動脈粥樣硬化斑塊處，均發(fā)現(xiàn)鐵沉積明顯增多，而在給予鐵螯合劑治療后，動脈粥樣硬化的情況有明顯好轉(zhuǎn)。斑塊內(nèi)的鐵沉積總是與巨噬細胞浸潤和泡沫細胞的出現(xiàn)密切相關(guān)。在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程中，鐵作為一種強氧化劑，可以通過Haber-Weiss反應(yīng)催化產(chǎn)生大

2、量活性氧，促進細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷蛋白質(zhì)和（或）核酸，促進巨噬細胞凋亡并釋放出大量細胞內(nèi)容物，這些物質(zhì)可以進一步促進巨噬細胞的侵潤，使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)不斷放大。
　　 鐵調(diào)素(hepcidin，Hep)是近年發(fā)現(xiàn)的一種在肝臟合成并富含半胱氨酸的抗菌多肽，具有抑制腸道鐵吸收和單核巨噬細胞系統(tǒng)鐵釋放的作用，是一種重要的負性鐵調(diào)節(jié)激素。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(ferroportinl，F(xiàn)P1)是巨噬細胞膜上已知唯一的鐵輸出蛋白。Hep與巨

3、噬細胞表面的FP1結(jié)合后，促進其內(nèi)吞和降解，使巨噬細胞內(nèi)的鐵增多，氧化作用增強。Hep的表達受炎性因子的調(diào)節(jié)，發(fā)生炎癥或感染時，一些細胞因子表達量增加促進鐵調(diào)素基因表達，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡。LPS、Interleukin-6(IL-6)、Interleukin-1（IL-1）均可促進體內(nèi)Hep水平的升高。
　　 2007年，SullivanJL等人提出了鐵調(diào)素與動脈粥樣硬化之間具有相關(guān)性的假說。新近的研究證實，鐵調(diào)素與代謝綜合征

4、具有相關(guān)性，認為在大約15％的代謝綜合征患者中存在鐵的超負荷，而這些患者中，大約50％的患者同時患有非酒精源性脂肪肝。近期，ValentiL等人的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在代謝綜合征患者中，血清鐵調(diào)素水平與血清MCP-1水平及血管損害程度相關(guān)，但對其發(fā)生機制未作進一步探討。
　　 綜上所述，盡管大量數(shù)據(jù)支持鐵代謝與動脈粥樣硬化的關(guān)系以及鐵調(diào)素對體內(nèi)鐵代謝的調(diào)控作用，當尚未獲得鐵調(diào)素與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性的直接證據(jù)。本論文擬通過建

5、立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，并分別在動物體內(nèi)過表達和干擾鐵調(diào)素基因，觀察鐵調(diào)素水平上調(diào)及干擾對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響并探討其分子機制，從而明確鐵調(diào)素在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展及斑塊不穩(wěn)定中的作用。
　　 目的：
　　 1.觀察鐵調(diào)素在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的表達水平，明確斑塊內(nèi)鐵調(diào)素表達的細胞類型;
　　 2.在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，以基因干預(yù)的方法，明確鐵調(diào)素對動脈粥樣

6、硬化斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　 3.探討鐵調(diào)素導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的可能機制。
　　 方法:
　　 1、重組腺病毒干擾載體與表達載體的的構(gòu)建及擴增
　　 擴增小鼠hepcidin基因，PCR產(chǎn)物與pMD18Tsimple載體連接，以EcoRI和BamHI為酶切位點，連接pMD18Tsimple-hamp和pIRES2-EGFP載體，保留測序驗證正確的pIRES2-EGFP-Hamp;設(shè)計針對hepcidin的sh

7、RNA，插入到miRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，保留測序驗證正確的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-hamp。將pIRES2-EGFP-Hamp和pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-hamp分別與腺病毒表達的目的載體pAD/CMV/V5-DEST進行LR重組反應(yīng)，以獲得含目的基因序列或目的基因干擾片段-GFP的腺病毒表達載體。將含目的基因序列的腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染293A細胞，包裝并純

8、化病毒。通過超速離心及層析的方法濃縮及純化病毒，獲得病毒濃縮液。僅表達EGFP的腺病毒載體作為對照。
　　 2、動物模型的建立及腺病毒轉(zhuǎn)染
　　 動物實驗分為兩部分進行。在第1部分動物實驗中，40只6周齡的雄性ApoE-/-小鼠隨機分為對照組和模型組，對照組給予全程普通飲食，模型組全程高脂飲食喂養(yǎng)并在第2周末行左頸總動脈套管術(shù)。兩組動物均于第13周末處死。在第2部分動物實驗中，75只6周齡的雄性ApoE-/-小鼠全程給予

9、高脂飲食喂養(yǎng)，第2周末行左頸總動脈套管術(shù)，術(shù)后8周隨機分為3組并分別轉(zhuǎn)染攜帶EGFP，EFP-hepcidin，和EGFP-hepcidinshRNA的重組腺病毒。3組動物繼續(xù)高脂喂養(yǎng)3周后于第13周末處死。
　　 3、血清指標檢測
　　 第2部分動物處死前心臟采血，檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖水平;同時檢測3組動物血清中鐵及鐵調(diào)素的水平。
　　

10、 4、組織病理與免疫組化檢測
　　 對左側(cè)頸動脈斑塊分別進行H&E染色、油紅O染色、天狼猩紅染色，并通過免疫組織化學方法檢測斑塊內(nèi)膠原、脂質(zhì)、巨噬細胞(MOMA-2)、平滑肌肌動蛋白(α-actin)含量。測量斑塊面積，觀察斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，計算易損指數(shù)。易損指數(shù)=（巨噬細胞+脂質(zhì)）陽性面積百分比/（平滑肌細胞+膠原）陽性面積百分比。
　　 通過免疫組織化學方法檢測斑塊內(nèi)炎性因子IL-6、MCP-1、TNFα、MMP-2以

11、及鐵相關(guān)蛋白hepcidin、H-Ferritin、L-Ferritin的表達水平。
　　 5、免疫熒光化學檢測
　　 以免疫雙標的方法檢測Hepcidin在斑塊巨噬細胞及平滑肌細胞的表達;同樣方法檢測ox-LDL在3組斑塊巨噬細胞內(nèi)的表達。
　　 6、non-Heme鐵檢測
　　 取新鮮頸動脈斑塊組織，以原子吸收分光光度儀法檢測3組斑塊內(nèi)non-heme鐵含量。
　　 7、實時定量RT-PCR檢

12、測
　　 取新鮮頸動脈斑塊組織，提取RNA，實時熒光定量RT-PCR檢測Hepcidin、H-Ferritin、L-Ferritin、IL-6、MCP-1、TNF-a、MMP-2等指標在mRNA水平的表達情況;取新鮮肝臟組織，提取RNA，實時熒光定量RT-PCR檢測3組動物肝臟HepcidinmRNA水平的表達情況。
　　 8、統(tǒng)計分析
　　 所有統(tǒng)計學數(shù)據(jù)均使用SPSS16.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差表

13、示，計數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計分析采用t檢驗、OnewayANOVA或LSDpost-hoc分析。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建重組腺病毒干擾載體與表達載體
　　 經(jīng)重組腺病毒載體測序驗證，Hep腺病毒表達載體及干擾載體構(gòu)建正確，病毒包裝成功，表達載體的病毒滴度為3.11×1012ifu/ml，干擾載體的病毒滴度為9.12×1012ifu/ml。
　　 2、

14、鐵調(diào)素在ApopE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的表達情況及細胞定位
　　 動物實驗的第1部分結(jié)果顯示，Hepcidin在對照組頸動脈血管內(nèi)幾乎不表達，但在模型組頸動脈斑塊內(nèi)存在mRNA和蛋白水平的高表達。兩組之間有顯著統(tǒng)計學差異。鐵調(diào)素主要在斑塊內(nèi)的巨噬細胞和平滑肌細胞表達，內(nèi)皮細胞未見鐵調(diào)素表達。
　　 3、腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率
　　 腺病毒局部轉(zhuǎn)染1周末GFP表達量明顯增加，兩周達到高峰，然后開始衰減，3周末實

15、驗結(jié)束時，斑塊內(nèi)仍可見GFP表達;轉(zhuǎn)染兩周后，GFP陽性面積與斑塊面積的平均比值在EGFP組、EGFP-Hep組及EGFP-Hep-shRNA組間沒有統(tǒng)計學差異。
　　 4、腺病毒轉(zhuǎn)染前后小鼠體重測量
　　 轉(zhuǎn)染前后各組間小鼠體重無明顯差異。
　　 5、血液生化指標檢測結(jié)果
　　 各組小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖未見統(tǒng)

16、計學差異，鐵調(diào)素基因干預(yù)對血脂、血糖水平無明顯影響。
　　 6、血清鐵水平檢測結(jié)果
　　 實驗結(jié)束時，血清鐵水平在三組間無顯著統(tǒng)計學差異。
　　 7、血清及肝臟Hepcidin水平檢測結(jié)果
　　 實驗結(jié)束時，ELISA檢測血清hepcidin水平，三組間無顯著統(tǒng)計學差異;各組小鼠肝臟Hepcidin在mRNA水平的表達無顯著統(tǒng)計學差異。
　　 8、斑塊內(nèi)Hepcidin表達檢測結(jié)果
　　

17、EGFP-Hep組與對照組相比，hepcidin的表達在蛋白和mRNA水平均升高，EGFP-Hep-shRNA組與對照組相比，hepcidin的表達在蛋白和mRNA水平均降低。
　　 9、斑塊面積檢測結(jié)果
　　 三組小鼠頸動脈斑塊面積平均值無顯著差異。
　　 10、斑塊成分檢測及易損指數(shù)測量結(jié)果
　　 油紅O染色檢測斑塊內(nèi)脂質(zhì)成分，EGFP、EGFP-Hep和EGFP-Hep-shRNA三組脂質(zhì)含量無顯著

18、差異;天狼猩紅染色檢測斑塊內(nèi)膠原成分，EGFP-Hep組較對照組膠原含量顯著減少，EGFP-Hep-shRNA組較對照組膠原含量顯著增加;MOMA-2免疫組化檢測斑塊內(nèi)巨噬細胞，EGFP-Hep組較對照組巨噬細胞含量顯著增加，EGFP-Hep-shRNA組較對照組巨噬細胞含量顯著減少;α-SMactin免疫組化檢測斑塊內(nèi)平滑肌細胞，EGFP-Hep組較對照組平滑肌細胞含量顯著減少，EGFP-Hep-shRNA組較對照組平滑肌細胞含量顯著

19、增多;EGFP-Hep組易損指數(shù)較對照組顯著增加，EGFP-Hep-shRNA組較對照組易損指數(shù)顯著降低。
　　 11、斑塊內(nèi)炎性因子檢測結(jié)果
　　 EGFP-Hep組IL-6、MCP-1、TNF-α和MMP-2的表達，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對照組均明顯升高(P＜0.05);反之，EGFP-Hep-shRNA組IL-6、MCP-1、TNF-α和MMP-2的表達，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對照組均明顯降

20、低（P＜0.05）。
　　 12、ox-LDL在巨噬細胞內(nèi)表達水平檢測結(jié)果
　　 免疫熒光雙標及激光共聚焦顯微鏡觀察ox-LDL在EGFP、EGFP-Hep和EGFP-Hep-shRNA三組巨噬細胞內(nèi)的表達百分比，EGFP-Hep組較對照組顯著升高，EGFP-Hep-shRNA組較對照組顯著降低。
　　 13、斑塊內(nèi)鐵蛋白表達水平檢測結(jié)果
　　 EGFP-Hep組L-Ferritin和H-Ferritin

21、的表達，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對照組均明顯升高;EGFP-Hep-shRNA組L-Ferritin和H-Ferritin的表達，無論在蛋白水平還是mRNA水平，較對照組均明顯降低。
　　 14、斑塊內(nèi)non-heme鐵檢測結(jié)果
　　 原子吸收分光光度儀檢測斑塊內(nèi)non-heme鐵的水平。EGFP-Hep組較對照組明顯升高;EGFP-Hep-shRNA組較對照組明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1