FⅩa對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及其機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種進(jìn)展性的炎癥性疾病，不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊破裂并繼發(fā)血栓形成可導(dǎo)致危及生命的急性心血管事件。FⅩa不僅在凝血級聯(lián)中占據(jù)著重要位置，對凝血酶的形成起到關(guān)鍵作用，而且越來越多的證據(jù)顯示FⅩa在炎癥反應(yīng)中也扮演著不可或缺的角色，因此本課題擬探討FⅩa對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及相關(guān)機制。
　　目的:
　　1.探討抑制FⅩa是否影響小鼠動脈粥樣硬化斑塊的病理進(jìn)展和穩(wěn)定性;
　　2.探討FⅩa影響動脈粥樣硬

2、化斑塊穩(wěn)定性的可能機制;
　　3.探討FⅩa對巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及可能機制。
　　方法:
　　1.FⅩa抑制劑對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊病理進(jìn)展的影響:選取6周齡大小的雄性ApoE-/-小鼠作為實驗小鼠，全程進(jìn)行高脂飼養(yǎng)，建立動脈粥樣硬化斑塊模型，20周齡時進(jìn)行為期4周的Fondaparinux(FⅩa抑制劑)腹腔注射，5mg/kg，1次/天。24周齡時麻醉稱重，心臟取血，檢測小鼠血漿中總膽固醇、甘油三

3、酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的水平。顯微鏡下取小鼠頭臂干，H&E染色法測量動脈粥樣硬化斑塊的病變面積、病變厚度、管腔狹窄程度、纖維帽厚度和壞死核比例，Masson染色法檢測斑塊中膠原含量，Perls染色法檢測斑塊內(nèi)出血情況，Van Kossa染色法檢測斑塊鈣化程度，免疫組化法檢測斑塊中FactorⅩ、α-SMA、Mac-2、VCAM-1、CD-31、MMP-9、PAR-1、PAR-2的表達(dá)，明膠酶譜法檢測斑塊中MMP-9的

4、酶活性，Western Bolt法檢測斑塊中PAR-1和PAR-2信號。顯微鏡下取小鼠胸主動脈，提取RNA，通過Real-time PCR法檢測主動脈組織中炎癥因子Egr-1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、MCP-1的表達(dá)水平。
　　2.FⅩa通過激活PAR-2發(fā)揮生物學(xué)特性:Western Blot法檢測巨噬細(xì)胞中PAR-1和PAR-2的表達(dá)情況，分別用thrombin(PAR-1特異性激動劑)、trypsin(

5、PAR-2特異性激動劑)刺激細(xì)胞30min，收集細(xì)胞，Western Blot法檢測ERK1/2磷酸化水平(PAR-1和PAR-2激活的指標(biāo))，評估巨噬細(xì)胞中PAR-1和PAR-2的功能活性。分別用不同濃度的FⅩa預(yù)處理細(xì)胞30min，收集細(xì)胞，WesternBlot法檢測ERK1/2磷酸化水平，評估FⅩa的最佳刺激濃度。分別用PBS、hirudin（凝血酶抑制劑）、TAP(FⅩa抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞30min，然后用FⅩa刺激細(xì)胞30m

6、in，收集細(xì)胞，Western Blot法檢測ERK1/2磷酸化水平，評估FⅩa誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的特異性。分別用PBS、ATAP2(PAR-1封閉抗體)孵化細(xì)胞30min，然后分別用thrombin、FⅩa刺激細(xì)胞30min，收集細(xì)胞，Western Blot法檢測ERK1/2磷酸化水平，證實FⅩa誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)不需要依賴PAR-1的激活。分別用thrombin和trypsin對細(xì)胞進(jìn)行脫敏處理，然后用FⅩa對脫敏細(xì)胞進(jìn)行刺激，收

7、集細(xì)胞，Western Blot法檢測ERK1/2磷酸化水平，證實FⅩa通過激活PAR-2誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。分別用PBS、TAP、SAM11(PAR-2封閉抗體)、U0126(ERK1/2抑制劑)預(yù)處理細(xì)胞，然后用FⅩa刺激細(xì)胞，收集細(xì)胞，提取RNA，通過Real-time PCR法檢測細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、MCP-1的表達(dá)情況，評估FⅩa對巨噬細(xì)胞致炎水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Fonda

8、parinux對小鼠的體重、血脂水平?jīng)]有影響，與對照組相比，F(xiàn)ondaparinux不影響斑塊的面積、厚度及管腔狹窄程度，但是顯著增加斑塊的纖維帽厚度(56.78±6.18μm vs42.35±2.62μm，P=0.049)和膠原含量（30.79±0.84％vs23.52±1.04％，P=0.006），降低斑塊的壞死核比例(34.8±0.91％vs41.32±1.44％,P=0.001)。
　　2.Fondaparinux不影響斑

9、塊中FactorⅩ的表達(dá)，顯著降低斑塊中α-SMA(5.67±0.54 vs8.10±0.52,P=0.002)、Mac-2(3.89±0.41 vs5.24±0.35,P=0.017)、VCAM-1(6.22±0.60 vs8.67±0.93,P=0.041)、CD-31(4.33±0.53 vs6.33±0.60，P=0.024)、MMP-9(4.22±0.33 vs7.45±0.44，P=0.000)、PAR-1(5.19±0.4

10、3 vs7.78±0.56，P=0.001)和PAR-2(3.13±0.30 vs4.77±0.40，P=0.003)的表達(dá)，F(xiàn)ondaparinux降低斑塊中MMP-9的酶活性（0.74±0.04 vs1.00±0.07，P=0.032），并減弱斑塊中PAR-1和PAR-2的信號傳導(dǎo)。
　　3.Fondaparinux降低小鼠體內(nèi)炎癥因子Egr-1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10和MCP-1的表達(dá)水平(P＜0.05

11、)。
　　4.PAR-1和PAR-2在巨噬細(xì)胞中有所表達(dá)，thrombin和trypsin能分別特異性激活巨噬細(xì)胞中的PAR-1和PAR-2。
　　5.FⅩa能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，0.75U/ml時效應(yīng)最強，TAP能阻斷這種信號傳導(dǎo)，而hirudin對FⅩa誘發(fā)的信號傳導(dǎo)則沒有影響。
　　6.ATAP2能阻斷thrombin誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，但是對FⅩa誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)沒有影響。與對照組相比，thrombin脫敏后的細(xì)

12、胞用FⅩa刺激仍能誘發(fā)細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，而trypsin脫敏后的細(xì)胞用FⅩa刺激則不能誘發(fā)細(xì)胞的信號傳導(dǎo)。
　　7.FⅩa增加巨噬細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和MCP-1的表達(dá)(P＜0.05)，而TAP、SAM11和U0126則能阻斷FⅩa的這種效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.抑制FⅩa不影響小鼠的體重、脂質(zhì)水平和動脈粥樣硬化斑塊的病理進(jìn)展，但是可以降低斑塊的炎癥水平、血管新生以及MMP-9的表達(dá)量和酶活性