IRX3在非酒精性脂肪性肝病和肝細胞癌中的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分 Irx3促進肝內脂質蓄積和肝脂肪變的研究
　　目的：研究Irx3在肝內脂質代謝中的作用及其分子機制。
　　方法：通過尾靜脈注射過表達或沉默Irx3的腺病毒及對照腺病毒的方法，在小鼠體內上調或下調Irx3的表達，并給予正?；蚋咧嬍?2周，檢測小鼠肝組織學變化、脂質蓄積情況及脂滴相關蛋白的表達水平。在轉染Irx3過表達腺病毒或對照腺病毒的小鼠肝細胞中，下調Fsp27β或Perilipin1的表達，并給予400μmol

2、/l油酸誘導，檢測肝細胞內脂質蓄積情況。此外，我們使用染色質免疫共沉淀和報告基因熒光素酶檢測等分子生物學的方法，研究Irx3是否能夠轉錄激活Fsp27β或Perilipin1的表達。
　　結果：上調肝內 Irx3的表達可促進肝內脂質蓄積和肝脂肪變，以及增加 Fsp27β和Perilipin1的表達；相反，下調肝內Irx3的表達可抵抗高脂飲食誘導的肝脂肪變，降低Fsp27β和Perilipin1的表達水平。但是脂滴相關蛋白Cidea

3、、Cideb、Atgl、Cgi-58和Perilipin2-4的表達不受Irx3表達變化的影響。與對照腺病毒轉染的肝細胞相比，Irx3過表達腺病毒轉染的肝細胞內TG含量明顯增加，但是在腺病毒介導的Irx3過表達的肝細胞內下調Fsp27β或Perilipin1的表達，導致細胞內TG含量顯著性降低。染色質免疫共沉淀和報告基因熒光素酶檢測結果顯示，Irx3能與Fsp27β和Perilipin1的基因啟動子片段結合，而過表達Irx3增強Fsp2

4、7β和Perilipin1的基因啟動子報告基因的熒光素酶活性。
　　結論：Irx3通過轉錄激活Fsp27β和Perilipin1的表達，促進肝內脂質蓄積和肝脂肪變。
　　第二部分 IRX3在肝細胞癌中的作用及表達調控研究
　　目的：研究IRX3在肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）中的作用，并從miRNA的角度探討其表達調控機制。
　　方法：采用qRT-PCR和Western bl

5、ot方法檢測HCC細胞系（HepG2和SMMC7721）和永生化肝細胞系LO2中IRX3和miR-377表達水平；慢病毒轉染HCC細胞構建IRX3穩(wěn)定表達和沉默的穩(wěn)定細胞株HepG2-shIRX3和SMMC7721-IRX3；采用CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞的增殖和克隆形成能力；采用劃痕實驗和 Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力；將miR-377 mimics或Control mimics轉染入HCC細胞，QRT-PC

6、R和Western blot方法檢測miR-377對IRX3的調控作用；運用報告基因技術證實miR-377是否可直接結合IRX33’UTR；將miR-377 mimics轉染入SMMC7721-IRX3細胞，CCK8、克隆形成、劃痕和Transwell實驗觀察miR-377是否能拮抗IRX3對細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。
　　結果：HepG2和SMMC7721細胞中IRX3 mRNA和蛋白水平均顯著高于LO2細胞；CCK-8實

7、驗結果顯示，與陰性對照相比，上調IRX3顯著提高了SMMC7721細胞的生長，而下調IRX3抑制了HepG2細胞的生長；克隆形成實驗顯示，SMMC7721-IRX3細胞比對照細胞產生了更多的細胞克隆，HepG2-shIRX3細胞產生的細胞克隆少于對照細胞；劃痕實驗和Transwell實驗顯示，上調IRX3顯著增強了SMMC7721的遷移和侵襲能力，而下調 IRX3顯著降低了 HepG2細胞的遷移和侵襲能力；miR-377在HepG2和S

8、MMC7721細胞中低表達；與轉染Control mimics相比，轉染了miR-377 mimics的HepG2和SMMC7721細胞中IRX3的蛋白表達水平明顯降低，mRNA水平無明顯差異；報告基因實驗顯示，miR-377顯著降低了IRX3-3’UTR-WT的熒光素酶活性，而IRX3-3’UTR-MUT不受miR-377影響；miR-377過表達消除了過表達IRX3對SMMC7721細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。
　　結論：