分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立及其對自噬功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.建立分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細胞源性泡沫細胞模型，探討分枝菌酸包被聚苯乙烯微球誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細胞泡沫細胞化的條件及特性。
　　2.建立穩(wěn)定表達pEGFP-LC3B的RAW264.7細胞模型。
　　3.探討分枝菌酸所致巨噬細胞泡沫細胞化對細胞自噬功能的影響。
　　方法:
　　1.將RAW264.7細胞分為空白對照組和分別包被0、25、50、75、100μg/mL分枝菌酸的聚苯乙烯微球?qū)嶒?/p>

2、組，分別將細胞與聚苯乙烯微球混勻，共同孵育24、48、72 h、5d和8d后，油紅O染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，采用總膽固醇試劑盒和游離膽固醇試劑盒測定各組泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯的含量，采用MTT法檢測細胞增殖水平。
　　2.以RT-PCR法擴增小鼠LC3B基因，雙酶切后插入真核表達載體pEGFP-C1中，構(gòu)建pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒。
　　3.經(jīng)雙酶切及測序鑒定后，將pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染小鼠巨噬

3、細胞RAW264.7，經(jīng)G418壓力篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆并將其擴大培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　4.將細胞分為三組，分別為空白RAW264.7細胞組、pEGFP-LC3B/RAW264.7細胞組以及用75μg/mL MA誘導(dǎo)5d的pEGFP-LC3B/RAW264.7細胞組。RT-PCR法檢測各組細胞中Becn1及LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western-blot法檢測各組細胞中蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比值變化。
　　

4、結(jié)果:
　　1.當包被分枝菌酸濃度為75μg/mL、吞噬時間為24h時，RAW264.7能形成典型的泡沫細胞，其細胞內(nèi)膽固醇酯相對含量為60.98％±1.32％;隨著吞噬時間延長，形成泡沫細胞所需的分枝菌酸的濃度逐漸遞減;且隨著細胞泡沫化程度增加，細胞增殖活力逐漸減弱。
　　2.經(jīng)雙酶切及測序鑒定，pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.將pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，經(jīng)G418加壓篩選

5、后獲得了表達綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。
　　4.與對照組相比，RAW264.7細胞誘導(dǎo)成為泡沫細胞后其Becn1基因轉(zhuǎn)錄水平和LC3B表達水平降低，蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細胞源性泡沫細胞模型。分枝菌酸包被聚苯乙烯微球可快速誘導(dǎo)巨噬細胞形成泡沫細胞，分枝菌酸濃度與細胞泡沫化程度呈正相關(guān)，且呈時間依賴性。
　　2.成功構(gòu)建p