經(jīng)RNA干擾技術(shù)修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的研究.pdf

1、背景:在同種異體移植中,受者對(duì)移植物的排斥反應(yīng)主要是受者T細(xì)胞介導(dǎo)的。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是重要的APC,而CD80/CD86則是DC表面上的最重要的協(xié)同刺激分子,通過(guò)與T細(xì)胞表面CD28分子結(jié)合可以協(xié)同激活初始型T淋巴細(xì)胞成為效應(yīng)細(xì)胞或記憶細(xì)胞,促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化,發(fā)揮其免疫排斥作用。RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)是一種調(diào)控細(xì)胞某種特定基因表達(dá)的特異而有效的方法,通過(guò)該方法抑

2、制DC表面的協(xié)同刺激分子的表達(dá),阻斷共刺激通路,可以誘導(dǎo)供體特異性的免疫耐受。
　　 目的:評(píng)估CD86基因的RNA干擾慢病毒對(duì)小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞的作用,檢測(cè)阻斷了CD86基因表達(dá)的樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能,并研究其相關(guān)的機(jī)制。
　　 方法:體外取C3H小鼠脛骨和股骨的骨髓,在含有rmGM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)液中分離培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞,待細(xì)胞培養(yǎng)至第二天時(shí),用CD86基因靶向的RNA干擾慢病毒感染樹(shù)突狀細(xì)胞,并通

3、過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)感染效率。樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)6天后加入脂多糖以促進(jìn)細(xì)胞成熟,然后收集細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子的表達(dá)。樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)Gamma-射線照射后按不同比例與通過(guò)免疫磁珠法從C57BL/6小鼠脾臟分離培養(yǎng)的T細(xì)胞做單向混合淋巴反應(yīng)培養(yǎng)3天,以[3H]-TdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞的增殖,并用AnnexinV/CD3雙參數(shù)法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)后T細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果:當(dāng)MOI=20時(shí),慢病毒對(duì)DC的感染

4、效率為79.78％。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,小鼠CD86基因靶向的RNA干擾慢病毒轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞顯著抑制了表面CD86分子的表達(dá)(P<0.05),而對(duì)CD80和MHC-Ⅱ的表達(dá)沒(méi)有影響(P＞0.05)。另外,與CD86慢病毒轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞作單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的T細(xì)胞的增殖反應(yīng)明顯弱于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P＜0.05),而與CD86慢病毒轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞作單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的T細(xì)胞的凋亡率則顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組