咖啡因對斑馬魚脂肪肝的保護作用及其機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過建立飲食誘導的斑馬魚幼魚NAFLD模型，同時探討咖啡因對斑馬魚幼魚肝內(nèi)脂質聚集的影響及可能的機制。從而為研究NAFLD的發(fā)病機制和治療藥物的篩選提供實驗模型。
　　方法：
　　1、確定斑馬魚幼魚發(fā)生脂肪肝的最適喂養(yǎng)量和喂養(yǎng)時間
　　2、探討咖啡因（caffeine）對飲食誘導的斑馬魚幼魚肝脂肪變性的影響
　　3、初步探討咖啡因(caffeine)減輕斑馬魚幼魚脂肪肝的可能機制
　

2、　4、尼羅紅熒光染色活體標記和成像過度喂養(yǎng)斑馬魚幼魚肝內(nèi)脂滴和體內(nèi)脂肪組織
　　結果：
　　1、過度喂養(yǎng)斑馬魚幼魚明顯發(fā)生了脂肪肝
　　通過測量不同喂養(yǎng)量和喂養(yǎng)時間幼魚的體重和體長，結果分析顯示幼魚體重和體長隨著每日喂養(yǎng)量的增加逐漸增加，喂養(yǎng)20天幼魚體重(2.063±1.624mg)明顯比喂養(yǎng)15天幼魚(1.108±0.7363mg)重(P＜0.001)。同樣地喂養(yǎng)20天幼魚體長（6.587±1.220mm）比喂養(yǎng)1

3、0天幼魚(4.885±0.5879mm)和喂養(yǎng)15天幼魚（5.594±0.7336mm）明顯長(P＜0.001)。然而，不同喂養(yǎng)組之間幼魚的死亡率并沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;喂養(yǎng)15天(19.25％)和喂養(yǎng)20天(21.47％)幼魚死亡率明顯比喂養(yǎng)10天幼魚(7.83％)高(P＜0.01），而喂養(yǎng)15天幼魚死亡率與喂養(yǎng)20天幼魚死亡率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。這些數(shù)據(jù)表明幼魚死亡率與每日喂養(yǎng)量無關，而是取決于幼魚本身內(nèi)在的因素

4、。整體油紅O染色方法評估顯示，隨著喂養(yǎng)量的增加，幼魚脂肪變性率逐漸升高;在每天喂養(yǎng)量120mg/d組和180mg/d喂養(yǎng)組幼魚脂肪肝發(fā)生率可達80％以上，但是在不同喂養(yǎng)時間組之間幼魚脂肪肝發(fā)生率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。整體油紅O染色、冰凍切片油紅O染色和HE染色顯示幼魚喂養(yǎng)10天后出現(xiàn)肝內(nèi)脂滴聚集，并且當幼魚喂養(yǎng)到15天和20天后肝內(nèi)脂滴數(shù)量增多，體積增大。然而，每日喂養(yǎng)量為20mg/d或30mg/d組幼魚肝臟基本上沒有脂質聚集，

5、表明該喂養(yǎng)量能維持幼魚正常的能量需要。而每日喂養(yǎng)量為120mg/d或180mg/d組幼魚顯示肝內(nèi)大量的脂滴聚集，這表明在該喂養(yǎng)量條件下幼魚處于能量過剩狀態(tài)。此外，檢測斑馬魚幼魚體內(nèi)甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCH)的含量，結果表明180mg/d喂養(yǎng)組幼魚喂養(yǎng)20天體內(nèi)TG含量(0.0142±0.0035mmol/gprotein)明顯比30mg/d喂養(yǎng)組幼魚體內(nèi)TG含量(0.0073±0.0034mmol/gprotein)高（P＜0

6、.01）），而兩組之間總膽固醇(TCH)含量并沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。因此，這些數(shù)據(jù)表明在過度喂養(yǎng)條件下斑馬魚幼魚易于發(fā)生肝臟脂肪變性，同時表明我們成功地建立了過度喂養(yǎng)誘導的斑馬魚幼魚脂肪肝模型，并將喂養(yǎng)量為30mg/d，喂養(yǎng)20天的幼魚定位正常喂養(yǎng)組，而喂養(yǎng)量180mg/d，喂養(yǎng)20天的幼魚為過度喂養(yǎng)組。
　　2、咖啡因降低過度喂養(yǎng)斑馬魚幼魚肝內(nèi)脂質的聚集
　　許多流行病學和臨床證據(jù)已表明咖啡和咖啡因對慢性肝臟疾病

7、具有保護作用，因此我們研究咖啡因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚幼魚中是否具有降低肝內(nèi)脂肪聚集的作用。首先，我們評估了咖啡因對幼魚體重的影響。我們發(fā)現(xiàn)在2.5％、5％和8％caffeine喂養(yǎng)組幼魚體重中比過度喂養(yǎng)組幼魚體重明顯減輕，但是在1％caffeine喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組之間幼魚體重沒有明顯差別。正如幼魚體重一樣，2.5％、5％、8％cafeine喂養(yǎng)組幼魚脂肪肝發(fā)生率和TG含量與過度喂養(yǎng)組比較明顯降低，而1％caffeine喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組

8、之間無差異。同時各不同喂養(yǎng)組之間總膽固醇含量并沒有統(tǒng)計學差異。接著連續(xù)冰凍切片HE染色和油紅O染色結果顯示2.5％、5％和8％caffeine喂養(yǎng)組幼魚肝內(nèi)脂滴數(shù)量和脂滴體積比1％caffeine喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組幼魚明顯減少。這些數(shù)據(jù)表明咖啡因能減輕過度喂養(yǎng)誘導的幼魚肝內(nèi)脂質聚集。
　　3、咖啡因參與調控脂質代謝通路、內(nèi)質網(wǎng)(ER)應激和炎癥反應相關的基因表達
　　為了探索咖啡因減輕肝內(nèi)脂滴聚集的可能機制，我們檢測了參與調

9、控脂質代謝基因的表達水平。qPCR結果顯示與過度喂養(yǎng)組幼魚相比，參與脂肪酸攝入的轉運蛋白的基因表達水平在5％caffeine喂養(yǎng)組中明顯的降低，如脂肪酸轉運酶基因(FAT/CD36);解耦聯(lián)蛋白-2(UCP-2)基因和參與脂質形成的轉錄因子基因如固醇調節(jié)元件結合轉錄因子-1（SREBP-1）表達水平也降低;參與脂肪酸合成的關鍵酶乙酰CoA羧化酶-1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FASN)表達含量也明顯降低。然而，參與脂肪酸β-氧化過程的乙

10、酰CoA氧化酶(ACO)基因表達水平在5％caffeine喂養(yǎng)組中明顯升高。接著我們在過度喂養(yǎng)的幼魚中探索咖啡因是否能影響ER功能而發(fā)揮保護肝臟的作用。qRT-PCR結果顯示過度喂養(yǎng)組組中參與ER應激的基因表達水平明顯比對照組(30mg/d)升高，包括基因IRE1、BIP和CHOP?？Х纫蛭桂B(yǎng)后，基因BIP和IRE1表達量明顯下降，并且ATF6和PERK的mRNA水平在咖啡因喂養(yǎng)組中也明顯降低，這表明咖啡因可下調參與ER應激的相關基因。

11、進一步我們檢測了炎癥因子基因的表達水平，觀察咖啡因是否可調節(jié)炎癥反應。結果顯示與正常喂養(yǎng)組比較，過度喂養(yǎng)組幼魚肝組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達含量明顯增加;而5％caffeine喂養(yǎng)后其表達含量又明顯降低;NF-κB的表達量各組之間沒有差異。除此之外，咖啡因處理后自噬相關基因ATG12和Beclin-1的表達水平降低。因此，這些結果表明咖啡因可能通過抑制脂質形成和脂肪酸攝入，改善內(nèi)置網(wǎng)功能及減輕肝內(nèi)炎癥反應而減輕幼魚肝內(nèi)的脂質

12、聚集。
　　4、尼羅紅染色活體標記和成像過度喂養(yǎng)幼魚肝內(nèi)脂滴和體內(nèi)脂肪細胞
　　我們選擇過度喂養(yǎng)20天幼魚，經(jīng)過尼羅紅染液處理后，在熒光顯微鏡下觀察。結果發(fā)現(xiàn)在幼魚肝內(nèi)和腹腔部位有明顯的強烈桔黃色信號，表明幼魚存在肝內(nèi)脂滴和腹腔脂肪細胞聚集。同時整體油紅O染色，白光顯微鏡和HE切片進一步證實肝內(nèi)脂滴和腹部脂肪細胞的存在。接著我們運用尼羅紅染色觀察不同喂養(yǎng)時間幼魚體內(nèi)脂肪組織的發(fā)生和分布。尼羅紅染色結果顯示5dpf斑馬魚幼魚還

13、未被完全吸收的卵黃囊。過度喂養(yǎng)2天的幼魚(即9dpf)胰腺位置出現(xiàn)中性脂質聚集，表明脂肪細胞最先出現(xiàn)在胰腺部位;喂養(yǎng)5天的幼魚(12dpf)腹腔中開始出現(xiàn)小脂滴，提示存在脂肪細胞聚集;而隨著喂養(yǎng)時間延長腹腔脂肪細胞聚集明顯增多，脂肪細胞出現(xiàn)的部位除腹腔外，還出現(xiàn)在其他部位如胸鰭部，眼眶周圍，尾鰭部，心包周圍，下頜部，皮下和背部。這表明隨著喂養(yǎng)時間延長斑馬魚體內(nèi)脂肪細胞數(shù)量和出現(xiàn)部位逐漸增加，說明不同部位脂肪組織的發(fā)生并不是同步的，斑馬魚

14、脂肪組織的形成按一定的順序存在時間和空間上的調控。此外，發(fā)現(xiàn)在過度喂養(yǎng)下斑馬魚肝臟在喂養(yǎng)5天后可出現(xiàn)明顯的脂質聚集，之后肝內(nèi)脂質聚集一直存在，表明斑馬魚易于發(fā)生肝內(nèi)脂質聚集。接著我們運用尼羅紅縱向觀察饑餓后斑馬魚脂肪組織和肝內(nèi)脂滴變化。首先，尼羅紅染色過度喂養(yǎng)的27dpf斑馬魚顯示腹腔內(nèi)脂肪細胞聚集和肝內(nèi)脂滴形成。而在斑馬魚饑餓1、2和4天后，腹腔脂肪組織明顯逐漸減少，肝臟體積和肝內(nèi)脂滴數(shù)量也逐漸減少。在饑餓5天后，腹腔內(nèi)脂肪組織和肝內(nèi)

15、脂滴基本消失，表明在饑餓狀態(tài)時，斑馬魚動用脂肪組織的脂肪和肝內(nèi)脂質維持能量供應。為了證明斑馬魚在重新給予喂養(yǎng)后脂肪組織重新出現(xiàn)，我們對饑餓5天后斑馬魚給予喂養(yǎng)。尼羅紅染色發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)2天后，斑馬魚腹腔內(nèi)又出現(xiàn)小脂滴，在重新喂養(yǎng)5天后，斑馬魚腹腔內(nèi)中性脂質明顯增加，而肝內(nèi)脂滴變化不是很明顯。這表明饑餓的斑馬魚重新喂養(yǎng)后，脂肪細胞可重新聚集脂質。
　　結論：
　　1、成功建立飲食的誘導的斑馬魚幼魚脂肪肝模型，為研究NAFLD發(fā)病機制