LSD1對斑馬魚發(fā)育的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、賴氨酸特異的脫甲基酶1(也稱為LSD1,BHC110或者AOF2)是第一個發(fā)現(xiàn)的組蛋白脫甲基酶。在CoREST(corepressor for REST)、BHC80和HADC等輔助因子幫助下,LSD1能夠使組蛋白H3-K4位脫去一個或二個甲基。組蛋白脫甲基后引起染色質(zhì)重塑或改變靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。通常H3-K4脫甲基化抑制靶基因轉(zhuǎn)錄活性,而H3-K9脫甲基化則導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄被激活。
　　 LSD1與很多疾病有密切的關(guān)系。例如,在

2、人腫瘤細(xì)胞中LSD1表現(xiàn)為沉默,而一些LSD1作用的靶基因卻大量表達(dá)。這些基因在癌癥的發(fā)展中有重要的作用。又如,lsd1敲除的小鼠在圍產(chǎn)早期死亡,這也導(dǎo)致難以深入研究lsd1在發(fā)育過程中的作用及其機(jī)制。模式生物斑馬魚胚胎透明、體外發(fā)育、個體小、繁殖率高以及其心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟以及視覺系統(tǒng)與人類相應(yīng)系統(tǒng)有許多共同點(diǎn),基因組序列與人的同源性更是達(dá)到75％以上。此外,斑馬魚所需部分的氧可以通過體表滲透,因此特別適用于心血管和血液

3、系統(tǒng)早期發(fā)育的研究。本課題就是利用斑馬魚作為模型來研究LSD1對于發(fā)育的影響并對其機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。
　　 第一部分LSD1在脊椎動物中的同源性及其在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的表達(dá)
　　 LSD1的cDNA共編碼689個氨基酸殘基,蛋白質(zhì)分子量約為110KD。生物信息學(xué)的方法聚類比較顯示LSD1在脊椎動物的進(jìn)化過程中,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常保守(同源性＞65％)。不同物種的LSD1蛋白質(zhì)分子上有兩個很保守的結(jié)構(gòu)域:SWIRM和FA

4、D結(jié)構(gòu)域;在斑馬魚發(fā)育中,lsd1在胚胎上表達(dá)從受精后一直持續(xù)到整個發(fā)育早期,而且lsd1的表達(dá)量始終處于高水平,特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中。
　　 第二部分斑馬魚中l(wèi)sd1基因表達(dá)下調(diào)方法的建立
　　 本研究通過嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸技術(shù)(morpholino)干擾目標(biāo)mRNA翻譯的方法下調(diào)lsd1表達(dá),并觀察斑馬魚發(fā)育受到的影響。我們設(shè)計(jì)了兩個具有剪接功能的嗎啡啉修飾反義寡核苷酸,下調(diào)了lsd1基因在斑馬魚中的表達(dá)。外顯子

5、11和17是LSD1功能蛋白必需的編碼序列,失去其中任何一段,LSD1即喪失脫甲基酶活性。RT-PCR結(jié)果顯示外顯子11和17在兩種MO注射后分別被剪切掉,這也驗(yàn)證了嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸的有效性,說明LSD1MO能夠有效下調(diào)內(nèi)源性的lsd1。此外,當(dāng)斑馬魚暴露在一定濃度的PCPA(＞20μM,反環(huán)苯丙胺)中,LSD1具有的組蛋白脫甲基酶活性H3-K4(2m)也被強(qiáng)烈抑制。
　　 第三部分lsd1基因表達(dá)下調(diào)對斑馬魚血液系統(tǒng)發(fā)

6、育的影響
　　 斑馬魚是研究血管和造血的良好模型,常被應(yīng)用于血管異常和造血障礙的研究。體外實(shí)驗(yàn)提示LSD1對于血細(xì)胞的分化起著重要作用。因?yàn)樵谛∈竽Ｐ椭兄滤佬?所以原始造血系統(tǒng)功能與LSD1的關(guān)系了解不多。我們利用斑馬魚第一次發(fā)現(xiàn)PCPA可以誘導(dǎo)斑馬魚的貧血現(xiàn)象,進(jìn)一步研究顯示貧血是由于原始造血系統(tǒng)被抑制造成的。這種貧血現(xiàn)象是由于與LSD1相關(guān)的表觀遺傳學(xué)變化引起的;嗎啡啉下調(diào)lsd1后,斑馬魚中出現(xiàn)了相似的貧血表型。表明原始造

7、血系統(tǒng)的發(fā)育需要LSD1的H3K4脫甲基酶參與。制備scl、lmo2、gata2、gatal、globin、pu.1、mpx、L-plastin和flk1探針進(jìn)行了胚胎整體原位雜交。結(jié)果顯示,血管發(fā)育基本不受影響,但是原始紅系細(xì)胞數(shù)量減少。紅系發(fā)育受阻的同時髓系發(fā)育則基本無影響。此外,血細(xì)胞流動速度也受到影響。
　　 第四部分lsd1基因表達(dá)下調(diào)對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響
　　 lsd1在斑馬魚的CNS部位持續(xù)高表達(dá)表明

8、LSD1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育上有一定的作用。PCPA曾作為臨床上使用的抑郁藥,因?qū)颊哂懈弊饔脤?dǎo)致使用范圍減小?？墒歉弊饔梅肿訖C(jī)制不詳。據(jù)報道,PCPA可以共價結(jié)合LSD1蛋白的FAD結(jié)構(gòu)域從而對其酶活性產(chǎn)生不可逆的抑制,從而調(diào)控與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因。我們觀察到濃度大于或等于75μM的PCPA處理的斑馬魚較對照組活躍程度下降。原位雜交顯示soxla和huc的表達(dá)水平下調(diào),TUNEL檢測結(jié)果說明上述現(xiàn)象是由于神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡。注射LSD1嗎啡