糖尿病小鼠腎小球入球動脈對內皮素-1的反應性變化及機制研究.pdf

1、糖尿病血管病變是糖尿病發(fā)病率和死亡率居高的重要因素。糖尿病影響血管功能，導致胰腺、腎、視網膜及神經等微血管并發(fā)癥。內皮功能障礙是加速糖尿病血管病變的始發(fā)因素并與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機制密切相關，主要表現為血管舒張因子與血管收縮因子之間的失衡。內皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是作用最強的血管收縮因子，亦是參與糖尿病血管病變發(fā)生及加速血管并發(fā)癥的重要因素。然而，迄今為止ET-1對糖尿病微血管的作用機制尚不明確，而對小血管和

2、微血管的深入研究更能揭示糖尿病及其血管并發(fā)癥的病理機制。
　　越來越多的人體或動物實驗證實糖尿病狀態(tài)下存在明顯的氧化還原平衡失衡，活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)過量產生是其主要特點，主要包括超氧陰離子(Superoxide anion，O2·-)和過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)。者作為體內主要的氧化還原代謝產物，并作為重要的信息傳遞分子影響血管活性。糖尿病狀態(tài)下的O2·

3、-及H2O2基礎水平均明顯升高，ET-1進一步刺激組織釋放O2·-。ET-1刺激培養(yǎng)的肺動脈內皮細胞，導致細胞內過氧化氫酶活性降低以及H2O2聚集，進而影響肺血流量。這些研究強烈提示氧化應激參與血管對ET-1的反應性。
　　糖尿病動物模型體內存在Wnt信號通路蛋白表達的異常，如Wnt5a和β-catenin表達量的下降。有文獻顯示，轉染特異的經典Wnt信號通路抑制劑Dickkopf1(DKK1)能顯著增加ROS水平。Nucleor

4、edoxin(NRX)作為硫氧還原蛋白家族的重要成員，通過作用于散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)，負性調控Wnt信號通路。研究表明，H2O2可以抑制環(huán)連蛋白(β-catenin)/T細胞因子(T cell factor, TCF)的轉錄活性，高表達Dvl能改善這種抑制作用。比較有趣的是，也有研究報道了截然相反的結果，即H2O2作用于細胞后增加了糖原合成激酶-3β(Glycogensynthasekinase-3β，GSK3β)

5、的去磷酸化，并暫時性激活TCF。以上研究結果均表明Wnt信號通路與氧化應激之間存在一定的關聯。
　　那么，糖尿病模型小鼠腎小球入球動脈對ET-1的反應性是否增強？增強的ET-1反應性是否與氧化應激異常相關？糖尿病動物模型是否存在經典Wnt/β-catenin通路的異常？經典Wnt/β-catenin信號通路與氧化應激是否存在關聯？采用Wnt信號通路特異性抑制劑能否削弱糖尿病狀態(tài)下增強的ET-1反應性？針對這些問題，本課題采用世界尖

6、端的、國內首創(chuàng)的微動脈微灌注技術，集中研究糖尿病動物模型及培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞中Wnt/β-catenin通路與氧化應激相關分子的關系，以探討糖尿病血管并發(fā)癥的相關分子機制。
　　第一部分:氧化應激在糖尿病小鼠腎小球入球動脈對內皮素-1反應性中的作用
　　目的:
　　本研究通過構建C57BL/6小鼠糖尿病模型，探討該模型下小鼠腎小球入球動脈對內皮素-1的反應性及氧化應激作用機制。
　　方法:
　　1.通過

7、給C57BL/6小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(70 mg/kg/d)連續(xù)四天，構建糖尿小鼠模型，腹腔注射等體積枸櫞酸-枸櫞酸鈉的C57BL/6小鼠作為正常對照組，每組均為10只。
　　2.采用世界尖端的、國內首創(chuàng)的、難度較高的顯微微灌注技術比較兩組小鼠腎小球入球動脈對ET-1的反應性，并確定不同類型ET-1受體的作用。
　　3.采用不同類型ROS清除劑孵育兩組小鼠腎小球入球動脈，探明H2O2和O2·-在不同條件介導的ET-1血管反

8、應性中的作用。
　　4.比較兩組小鼠腎小球入球動脈在不同的時間點對H2O2（10μM）的反應性。
　　5.采用熒光探針法檢測顯微微灌注的兩組小鼠腎小球入球動脈中的基礎及ET-1刺激下的ROS熒光信號。
　　6.采用Western blot法檢測兩組小鼠球前動脈中ETA和ETB受體蛋白表達。
　　結果:
　　1.糖尿病條件下，腎小球入球動脈對ET-1的反應性增強，且增強的反應主要由ETB受體調節(jié);正常條件下的

9、ET-1血管反應性主要由ETA受體調節(jié)。
　　2.糖尿病條件下，球前動脈ETA和ETB受體蛋白表達均明顯增多。
　　3.糖尿病條件下，H2O2和O2·-均參與增強的ET-1血管反應性。
　　4.H2O2呈時間依賴性收縮糖尿病條件下的腎小球入球動脈。
　　5.糖尿病條件下基礎的H2O2和O2·-熒光增多，ET-1呈濃度依賴性方式誘導更多的O2·-，但不影響H2O2的釋放。
　　結論:
　　本研究表明，糖

10、尿病增強腎小球入球動脈對ET-1的反應性，且這種效應主要由ETB受體調節(jié)，H2O2和O2·-共同參與此過程。ET-1能促進腎小球入球動脈O2·-釋放，但不影響H2O2的釋放。
　　第二部分:經典Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病小鼠內皮素-1血管反應性中的作用及對氧化應激水平的影響
　　目的:
　　本研究探討經典Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病模型小鼠ET-1血管反應性中的作用及對氧化應激水平的影響。

11、
　　方法:
　　1.C57BL/6小鼠糖尿病模型構建成功第二天開始給予舒林酸(sulindac)處理，按照40 mg/kg/d劑量灌胃給藥，連續(xù)四周，同期對照組接受等量等體積sulindac。實驗共分成四組:對照組（Control組），對照組+sulindac（Control+S組），糖尿病組（DM組）及糖尿病組+sulindac（DM+S組），每組均為10只。
　　2.采用Western blot和real-tim

12、e PCR法檢測不同模型小鼠球前動脈中Wnt信號分子的表達。
　　3.采用Western blot和real-time PCR法檢測不同模型小鼠球前動脈中抗氧化應激分子的表達，評估Wnt信號通路在抗氧化應激水平的作用。
　　4.比較不同模型小鼠球前動脈中H2O2和O2·-濃度及過氧化氫酶(CAT)和總超氧化物歧化酶(SOD)活力大小，評估Wnt信號通路的功能。
　　5.采用顯微微灌注技術比較不同模型小鼠腎小球入球動脈對

13、ET-1的血管反應性。
　　6.采用熒光探針法檢測顯微微灌注的不同模型小鼠腎小球入球動脈中的基礎和ET-1刺激下的ROS熒光信號，評估Wnt信號通路的功能。
　　結果:
　　1.糖尿病激活經典Wnt信號通路，抑制Wnt信號通路后氧化應激分子H2O2和O2·-含量減少，catalase和總SOD酶活力回升，抗氧化應激蛋白分子catalase和SOD2表達上調。
　　2.Sulindac通過減少糖尿病下增多的H2O2

14、和O2·-，削弱增強的ET-1血管反應性。
　　結論:
　　本研究表明，糖尿病激活經典Wnt信號通路，抑制該通路活性后，H2O2和O2·-降放減少，從而削弱了增強的ET-1血管反應性。
　　第三部分:高糖處理的人臍靜脈內皮細胞經典Wnt/β-catenin信號通路上調氧化應激水平
　　目的:
　　高糖培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞，探討經典Wnt/β-catenin信號通路與氧化應激在糖尿病發(fā)生過程中的作用。

15、　　方法:
　　1.HUVECs中加入不同濃度葡萄糖(5.5，25，50，75，100 mM)培養(yǎng)24或48 h;加入不同濃度sulindac（0.15，0.25，0.5mM）培養(yǎng)24或48 h;在高糖(50mM)培養(yǎng)24或48 h的基礎上加入不同濃度sulindac(0.15，0.25，0.5 mM)繼續(xù)培養(yǎng)1h。
　　2.葡萄糖或sulindac或葡萄糖+sulindac處理后，行細胞活力檢測確定二者理想濃度。
　

16、　3.葡萄糖或葡萄糖+sulindac處理后，采用Western blot和real-time PCR法檢測各組細胞中Wnt信號分子的表達，并設立26.5 mM甘露醇作為對照組排除滲透壓所帶來的影響。
　　4.葡萄糖或葡萄糖+sulindac處理后，采用Western blot和real-time PCR法檢測各組細胞中抗氧化應激分子的表達，評估Wnt信號通路在抗氧化應激水平的作用。
　　5.葡萄糖或葡萄糖+sulindac

17、處理后，檢測細胞中ROS熒光信號，評估Wnt信號通路的功能。
　　6.葡萄糖+sulindac處理后，加入tempol(1 mM)作用1h，采用Western blot法檢測各組細胞中抗氧化應激分子及Wnt信號通路相關蛋白的表達，評估氧化應激影響Wnt信號通路活性的變化。
　　結果:
　　1.葡萄糖呈濃度依賴性減少HUVECs活力，0.5 mM sulindac作用后恢復HUVECs低活力狀態(tài)。
　　2.50 m

18、M葡萄糖作用HUVECs24或48 h模擬糖尿病高氧化應激，經典Wnt信號通路被激活。抑制Wnt信號通路后，細胞中H2O2和O2·-釋放減少，catalase和SOD2表達上調，此作用獨立于滲透壓變化。
　　3.Tempol增加高糖所致的SOD2低表達，不影響catalase表達，不影響經典Wnt信號通路蛋白的表達。
　　結論:
　　本研究表明，高糖激活經典Wnt信號通路，抑制該通路活性后，H2O2和O2·-釋放減少，