芪術(shù)顆粒對糖尿病腎病與腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎?。―iabetes nephropathy，DN）是糖尿病患者中最常見的微血管并發(fā)癥之一，糖尿病腎病的腎損害可以累及腎臟的所有結(jié)構(gòu)。患者一旦進(jìn)入DN末期，將完全依靠透析或腎移植維持生命。因此，DN一直是臨床中亟待攻克的醫(yī)學(xué)難題，研究并開發(fā)治療DN機(jī)制明確，療效確切的藥物是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
　　芪術(shù)顆粒（Qizhu granules，QZG）是本實(shí)驗(yàn)室自主研制的復(fù)方中藥，由黃芪、女貞子、黃蜀葵花、白術(shù)、赤

2、芍、金櫻子、黃連、綿萆薢等8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血利水之功。主要用于糖尿病腎病早期伴有尿蛋白者脾腎兩虛，濕濁瘀阻證。本課題采用糖尿病腎病大鼠模型與高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞(MCs)損傷模型，從體內(nèi)與體外兩方面研究QZG對糖尿病腎病的影響及機(jī)制研究。
　　內(nèi)容與方法:
　　1.QZG對糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用
　　采用高脂飼料喂養(yǎng)+鏈尿菌素(STZ)腹腔注射+單側(cè)腎臟結(jié)扎的復(fù)合方法制備Ⅱ型糖尿病腎病模型，實(shí)驗(yàn)分為

3、正常對照組、模型對照組、芪術(shù)顆粒高劑量組（20g生藥/kg）、芪術(shù)顆粒中劑量組（10g生藥/kg）、芪術(shù)顆粒低劑量組(5g生藥/kg)、纈沙坦組(10mg/kg)，連續(xù)給藥8周，評價(jià)QZG對DN的腎保護(hù)作用。主要包括:24h-尿量(24h-Volume，24h-V)、24h-尿蛋白(24h-urinary protein，24h-Upro)、尿肌酐(urinary creatinine，UCr)、尿素氮(Blood urea nitro

4、gen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)、甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等生化指標(biāo)檢測。蘇木素-伊紅液染色（Hematoxylin and eos

5、in stain，HE）光鏡觀察腎臟病理形態(tài)變化情況。
　　2.QZG抗糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響
　　原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)測定QZG對糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響，免疫組織化學(xué)染色法檢測腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase3表達(dá)水平。
　　3.QZG主要成分對MCs的細(xì)胞活力的影響
　　將96孔培養(yǎng)板中的

6、MCs分為正常組、0.1％DMSO溶劑組、特女貞苷(SPE)，黃芪甲苷(AS-Ⅳ)、金絲桃苷(HYP)組，藥物濃度設(shè)置均為1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8125μmol·L-1，培養(yǎng)24h，MTT法檢測細(xì)胞活力。
　　4.QZG主要成分對高糖培養(yǎng)的MCs損傷的保護(hù)作用
　　高糖培養(yǎng)（25 mmol·L-1）腎小球系膜細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，將細(xì)胞分為正常組、模型組、纈沙坦（100μm

7、ol·L-1）、特女貞苷、黃芪甲苷、金絲桃苷組，實(shí)驗(yàn)藥物的濃度設(shè)置均為100、50μmol·L-1，分別培養(yǎng)12h，24h，48h， CCK-8法檢測MCs增殖水平，ELISA法檢測MCs分泌TGF-β1、FN和Col-Ⅳ的濃度。
　　5.QZG主要成分對高糖培養(yǎng)的MCs凋亡的影響
　　高糖培養(yǎng)（25 mmol·L-1）建立腎小球系膜細(xì)胞損傷模型，將細(xì)胞分為正常組、模型組、纈沙坦（100μmol·L-1）、特女貞苷、黃芪甲苷

8、、金絲桃苷組，實(shí)驗(yàn)藥物的濃度設(shè)置均為100、50μmol·L-1，培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞技術(shù)FITC AnnexinⅤ和PI雙染法觀察細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測腎小球系膜細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.QZG對糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用
　　(1) QZG可顯著降低DN大鼠24h尿蛋白排泄量。
　　(2) QZG可明顯增加DN大鼠尿肌酐的排泄。
　　(3

9、) QZG可顯著降低DN大鼠血清TG、TC、HDL-C水平。
　　(4) QZG可以明顯改善DN大鼠腎小管萎縮或者擴(kuò)張、間質(zhì)中纖維組織增生;腎小球血管球萎縮或者擴(kuò)張、系膜基質(zhì)增生、炎性分泌物黏連，腎小囊纖維組織增生。
　　2.QZG抗糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響
　　(1) QZG可顯著改善DN腎臟細(xì)胞凋亡。
　　(2) QZG可顯著改善模型對照組腎小球和腎小管細(xì)胞Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)。
　　3

10、.QZG主要成分對MCs的細(xì)胞活力的影響
　　(1) SPE最大安全濃度為125μmol·L-1。
　　(2) AS-Ⅳ在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)安全無毒。
　　(3) HYP最大安全濃度為125μmol·L-1。
　　4.QZG主要成分對高糖培養(yǎng)的MCs損傷的保護(hù)作用
　　(1) QZG主要成分SPE作用12h、24h、48h，可明顯降低高糖誘導(dǎo)的MCs的增殖，具有明顯的量效關(guān)系;藥物作用48h可顯著性抑制高糖培養(yǎng)的M

11、Cs分泌TGF-β1、FN和Col-Ⅳ。
　　(2) QZG主要成分AS-Ⅳ作用12h、24h、48h，可明顯降低高糖誘導(dǎo)的MCs的增殖，具有明顯的量效關(guān)系;藥物作用48h可顯著性抑制高糖培養(yǎng)的MCs分泌TGF-β1、FN和Col-Ⅳ。
　　(3) QZG主要成分HYP作用12h、24h、48h，可明顯降低高糖誘導(dǎo)的MCs的增殖，具有明顯的量效關(guān)系;藥物作用48h可顯著性抑制高糖培養(yǎng)的MCs分泌TGF-β1、FN和Col-Ⅳ

12、。
　　5.QZG主要成分對高糖培養(yǎng)的MCs凋亡的影響
　　(1) QZG主要成分SPE作用48h可顯著性減少高糖培養(yǎng)的MCs的細(xì)胞凋亡率升高，降低cleaved-caspase3以及Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。
　　(2) QZG主要成分AS-Ⅳ作用48h可顯著減少高糖培養(yǎng)的MCs的細(xì)胞凋亡率升高，降低cleaved-caspase3以及Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。
　　(3) QZG主要成分HYP