Smad信號通路調(diào)控BMP9介導的iSCAP成骨-成牙本質(zhì)分化的機制研究.pdf

1、目的：課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（BMP9）在誘導小鼠永生化根尖牙乳頭干細胞（iSCAP）向成骨/成牙本質(zhì)方向分化方面能力較強，但目前對于相關(guān)分子學機制的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，Smad信號通路屬于BMP信號傳導系統(tǒng)中的經(jīng)典通路。因此，本課題主要是研究BMP9是否能夠激活iSCAP細胞中的Smad信號通路，以及Smad信號通路在BMP9誘導iSCAP細胞成骨/成牙本質(zhì)向分化中的作用。
　　方法：首先，用Ad-BMP9轉(zhuǎn)染iSC

2、AP，36h后采用Western免疫印跡實驗檢測Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。隨后，用顯性負性突變受體 ALK1（dnALK1）重組腺病毒和 BMP9條件培養(yǎng)基共同作用于iSCAP，通過Western免疫印跡實驗檢測Smad1/5/8蛋白磷酸化水平；然后，分別采用堿性磷酸酶（ALP）活性檢測和染色方法分析 iSCAP早期成骨/成牙本質(zhì)指標變化，Western印跡實驗檢測中晚期成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白OCN、OPN表達，茜素紅染色法檢

3、測鈣鹽沉積程度；最后，通過實時熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測dnALK1對BMP9誘導iSCAP成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表達的影響。
　　結(jié)果：BMP9可上調(diào)iSCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平；dnALK1競爭性抑制BMP9條件培養(yǎng)基的作用后，Smad1/5/8的磷酸化水平下調(diào)，BMP9誘導的iSCAP細胞中早期成骨/成牙本質(zhì)標志物堿性磷酸酶活性下降，中晚期成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白 O

4、CN、OPN表達減少，晚期成骨/成牙本質(zhì)標志鈣鹽結(jié)節(jié)減少。RT-PCR結(jié)果顯示重要成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達減少，成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因OCN、OPN、DMP1的表達也受到了抑制。
　　結(jié)論：Smad信號通路在BMP9誘導iSCAP成骨/成牙本質(zhì)過程中存在并起著重要作用。ALK1是BMP9-Smad信號通路中的重要受體， dnALK1能有效拮抗 BMP9蛋白的活性，但是否同樣抑制其他信號通路還需要進一步研究，后續(xù)我們將通過體內(nèi)