氯化鋰對血管性認知功能障礙小鼠認知功能的影響及機制研究.pdf

1、血管性認知功能障礙(vascular cognitive impairment, VCI)是由各種腦血管疾病引起的以學習記憶功能損害為主要癥狀的智能障礙綜合征。隨著我國老年人口規(guī)模的增加和老齡化速度的加快，腦血管病的發(fā)病率也逐年增高，嚴重影響了老年人的生活質(zhì)量，并有年輕化的趨勢。腦血管病除了引起肢體功能障礙以外，還會引起認知功能障礙和情緒異常。因此早期采取積極有效的預防和治療對減輕患者個人及家庭的負擔具有重要意義。
　　反復腦缺血

2、再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷是VCI重要的病理生理學機制之一。制備反復腦IR動物模型能很好的模擬臨床患者VCI的過程，是研究VCI發(fā)病機制的有效方法。眾所周知，鋰劑是一種治療雙向情感障礙的情緒穩(wěn)定劑。近年鋰劑也作為一種治療神經(jīng)退行性疾病和腦血管性疾病的神經(jīng)保護性藥物使用。但是，鋰劑對反復腦IR引起學習記憶損害的分子機制還不十分清楚。
　　研究表明，海馬是學習、記憶的主要場所，也是缺血易損區(qū)。蛋白激酶

3、B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β，GSK-3β)信號通路是神經(jīng)營養(yǎng)因子依賴性信號通路中的主要成員，在改善海馬學習記憶中發(fā)揮重要作用。反復腦IR導致大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成進而引起脂質(zhì)過氧化損傷，及時有效的減輕氧化應(yīng)激損傷可能是防治VCI的可行方法之一。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derive

4、d neurotrophic factor, BDNF)是腦內(nèi)最豐富的神經(jīng)生長因子，缺乏生長因子可促進神經(jīng)凋亡。BDNF也能通過刺激B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)家族成員表達發(fā)揮抗凋亡作用達到神經(jīng)保護的效果。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)是BDNF基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過133位絲氨酸磷酸化激活

5、的CREB參與突觸可塑性、長時記憶形成和鞏固。
　　基于上述研究背景，我們采用反復三次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(bilateralcommon carotid artery occlusion，BCCAO)的方法，建立反復腦IR損傷致VCI小鼠模型，術(shù)前或術(shù)后應(yīng)用不同劑量氯化鋰(lithium chloride，LiCl)進行干預，觀察:(1) LiCl是否能通過調(diào)節(jié)Akt、GSK-3β蛋白表達改善小鼠學習記憶功能和海馬組織形態(tài)學異常;(

6、2) LiCl是否能通過調(diào)節(jié)MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性等指標，抑制氧化應(yīng)激損害;
　　(3) LiCl是否能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、BDNF、CREB基因或蛋白表達抑制凋亡、激活BDNF/CREB信號通路以改善認知功能。
　　第一部分氯化鋰對血管性認知功能障礙小鼠Akt/GSK-3β通路的影響
　　目的:通過反復三次BCCAO法建立VCI小鼠模型，觀察術(shù)后2周、4周、6周Akt和GSK-3

7、β活性改變是否參與了反復腦IR致學習記憶損害，并進一步探討2mmol/Kg LiCl術(shù)后給藥是否能通過增強或抑制這種變化發(fā)揮治療認知功能障礙的神經(jīng)保護作用。
　　方法:清潔級健康雄性C57B1/6小鼠(C57小鼠)144只，隨機分為4組:(1)氯化鈉假手術(shù)組(NaCl-treated sham group，n=36);(2)氯化鈉模型組(NaCl-treated model group，n=36);(3)氯化鋰假手術(shù)組(LiCl-

8、treatedsham group，n=36);(4)氯化鋰模型組(LiCl-treated model group，n=36)。每組于術(shù)后2周、4周、6周進行觀察（每亞組12只）。模型組采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎20min，放開10min，反復循環(huán)三次的方法制備VCI模型。LiCl組小鼠術(shù)后給予每天一次腹腔注射2mmol/Kg LiCl。最后一次給藥的次日，采用水迷宮自動記錄儀對所有存活小鼠進行為期4天的水迷宮實驗，記錄第3天和第4天小鼠找

9、到逃生梯的時間（游泳時間）和進入盲端的次數(shù)（錯誤次數(shù)）作為評測學習和記憶功能的指標。行為學測試結(jié)束后，采用HE染色觀察小鼠海馬組織形態(tài)學變化，TUNEL染色觀察海馬組織神經(jīng)元凋亡變化，Western blot法分析Akt和GSK-3β蛋白表達變化。
　　結(jié)果:在NaCl和LiCl模型組小鼠，死亡率分別為16.67％和11.11％。其中，NaCl模型組小鼠術(shù)后2周、4周、6周各死亡小鼠2、1、3只;LiCl模型組小鼠術(shù)后2周、4周、

10、6周各死亡小鼠1、1、2只。假手術(shù)組小鼠術(shù)后未見死亡。
　　行為學測試中，術(shù)前各組小鼠學習階段和記憶階段游泳時間和錯誤次數(shù)無明顯差異，認知功能水平基本相同(P＞0.05)。術(shù)后，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠學習階段和記憶階段游泳時間均延長，錯誤次數(shù)均增多（p＜0.05）。與NaCl組小鼠相比，LiCl組小鼠游泳時間明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。在術(shù)后2周、4周、6周整個觀察期間，這種作用持續(xù)存在，但以術(shù)后4周最明顯。<

11、br>　　HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl和LiCl假手術(shù)組小鼠海馬錐體細胞數(shù)量多，排列緊密有序，細胞核大而圓，核仁明顯，極少見TUNEL陽性細胞。相比之下，NaCl模型組小鼠術(shù)后4周、6周海馬錐體細胞數(shù)量減少，排列松散，細胞核固縮深染，核仁消失，并可見大量TUNEL陽性神經(jīng)元(P＜0.05)。術(shù)后4周損傷最明顯，部分區(qū)域僅見少量神經(jīng)元存活。LiCl組細胞數(shù)量減少和核固縮不明顯，凋亡細胞數(shù)量減少(P＜0.05)。尤其在術(shù)后4周和6周改善明顯。

12、
　　Western blot法檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)，LiCl模型組小鼠phospho-AktSer473和phospho-GSK-3β Ser9蛋白表達增高(P＜0.05)。NaCl模型組小鼠phospho-Akt Ser473和phospho-GSK-3β Ser9蛋白表達比假手術(shù)組小鼠也有增高，但增高程度低于LiCl組小鼠。這兩種蛋白表達量以術(shù)后4周增高最明顯。
　　結(jié)論:反復腦IR法制備的VCI小鼠模型，能有效的模擬學習

13、記憶功能障礙和海馬形態(tài)學異常，給予術(shù)后不同時間2 m1mol/kg LiCl處理均可不同程度改善海馬形態(tài)學異常，減輕凋亡反應(yīng)，激活Akt/GSK-3β信號轉(zhuǎn)導通路，提高VCI小鼠空間學習記憶能力，改善認知功能。
　　第二部分氯化鋰不同劑量和不同時間給藥對血管性認知功能障礙小鼠認知功能和海馬組織形態(tài)學的影響
　　目的:給予VCI小鼠術(shù)前和術(shù)后2 mmol/kg或5mmol/kg LiCl處理，術(shù)后4周利用Morris水迷宮進行

14、行為學測試，尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學異常，進一步探討LiCl改善認知功能的作用。
　　方法:60只C57小鼠隨機分為6組:(1)假手術(shù)組(sham group);(2)模型組(vehicle group);(3)氯化鋰低劑量術(shù)前組(pre-LiCl-low model group，pre-Li-L);(4)氯化鋰低劑量術(shù)后組(LiCl-low model group，Li-L);(5)氯化鋰高劑量術(shù)前組(pre-LiCl-hi

15、gh model group，pre-Li-H);(6)氯化鋰高劑量術(shù)后組(LiCl-highmodelgroup，Li-H)。每組10只。模型組、LiCl術(shù)前組和術(shù)后組均采用三次BCCAO致反復腦IR法制備VCI模型。LiCl術(shù)前組于造模前連續(xù)7天給予每天一次2 mmol/kg（低劑量）或5mmol/kg（高劑量）LiCl腹腔注射，LiCl術(shù)后組于造模后給予每天一次2 mmol/kg（低劑量）或5 mmol/kg（高劑量）LiCl腹腔

16、注射，連續(xù)28天。最后一次給藥的次日，所有存活小鼠進行為期6天的Morris水迷宮實驗，測試小鼠空間學習記憶能力。(1)定位航行實驗(Place navigation test):連續(xù)訓練5天，每天訓練6次，記錄小鼠從入水到尋臺成功的時間，即逃避潛伏期(escape latency)，反映小鼠空間學習能力。(2)空間探索實驗(Spatial probe test):在定位航行實驗結(jié)束的第二天，撤除平臺，記錄小鼠60s內(nèi)在原平臺象限的停留

17、時間占總時間的百分比（目標象限停留時間百分比）以及穿過原來平臺所在位置的次數(shù)（穿臺次數(shù)），反映小鼠空間記憶能力。行為學測試結(jié)束后，尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學變化并對正常神經(jīng)元進行計數(shù)。
　　結(jié)果:在定位航行階段，隨著訓練天數(shù)的增加，各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短。從訓練第2天開始，VCI小鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組小鼠明顯延長，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);第3天，低劑量術(shù)后組、高劑量術(shù)前組和高劑量術(shù)后組小鼠表現(xiàn)出逃避潛伏期較VCI模

18、型組小鼠明顯縮短(P＜0.05);第4、5天低劑量術(shù)前組、低劑量術(shù)后組、高劑量術(shù)前組和高劑量術(shù)后組小鼠逃避潛伏期均較VCI模型組小鼠明顯縮短(P＜0.05)，低劑量術(shù)后組差異最明顯。同時經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，高劑量術(shù)前組小鼠逃避潛伏期較低劑量術(shù)前組縮短，而高劑量術(shù)后組卻較低劑量術(shù)后組延長，但均無統(tǒng)計學差異。在空間探索階段，與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠在目標象限停留時間百分比明顯降低(P＜0.05)，穿臺次數(shù)也明顯減少（P＜0.05）。與VCI

19、模型組小鼠相比，低劑量術(shù)前組、低劑量術(shù)后組、高劑量術(shù)前組和高劑量術(shù)后組小鼠在目標象限停留時間百分比均明顯增加(P＜0.05)，穿臺次數(shù)也明顯增加(P＜0.05)。
　　行為學測試完畢后，尼氏染色觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列緊密、均勻，層次清楚，細胞形態(tài)、大小正常，結(jié)構(gòu)完整，胞核大而圓，核仁清晰可見，胞漿尼氏體豐富。與假手術(shù)組相比，術(shù)后4周VCI模型組小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元缺失明顯，排列疏松，錐體神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則

20、，神經(jīng)元胞體呈梭形或多角形，胞核固縮，正常神經(jīng)元計數(shù)明顯減少(P＜0.05)。給予2mmol/Kg和5mmol/KgLiCl術(shù)前和術(shù)后給藥處理后，上述異常都明顯減輕，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元丟失明顯減少，正常神經(jīng)元計數(shù)明顯增多(P＜0.05)，細胞排列較為緊密有序，存活細胞邊緣較清晰，胞體形態(tài)較飽滿，可見少量胞核固縮，以低劑量術(shù)后組改善最明顯。
　　結(jié)論:反復腦IR損傷制備的VCI小鼠術(shù)后4周在Morris水迷宮測試中表現(xiàn)出明顯的空

21、間學習記憶功能受損，伴有海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常、數(shù)量減少，2mmol/Kg和5mmol/Kg LiCl術(shù)前和術(shù)后給藥都能明顯改善行為學異常、增加存活神經(jīng)元數(shù)量，以低劑量術(shù)后給藥效果最好。
　　第三部分氯化鋰不同劑量和不同時間給藥對血管性認知功能障礙小鼠海馬組織氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的:觀察反復腦IR后不同時間點海馬組織MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性的動態(tài)變化，探討氧化應(yīng)激損傷在反復腦IR中的作用

22、，并觀察LiCl不同劑量和不同時間給藥對海馬組織MDA含量、SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性的影響，探討LiCl是否能通過提高抗氧化酶活性和降低自由基作用，達到減輕氧化應(yīng)激損傷、發(fā)揮腦保護作用。
　　方法:第一階段:24只C57小鼠隨機分為6組:(1)假手術(shù)組(shamgroup);(2)術(shù)后1天組(1d);(3)術(shù)后3天組(3d);(4)術(shù)后7天組(7d);(5)術(shù)后14天組(14d);(6)術(shù)后28天組(28d)。每組

23、4只。第二階段:分組情況同第二部分。對術(shù)后不同時間點以及LiCl不同劑量和不同時間給藥的各組小鼠海馬組織，采用硫代巴比妥酸法檢測海馬組織MDA含量，WST-1法檢測SOD活性、化學比色法檢測GSH-PX活性和可見光法檢測CAT活性。
　　結(jié)果:與假手術(shù)組相比，術(shù)后1天、3天、7天、14天和28天，MDA含量持續(xù)增高，7天時達到統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，28天時仍明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。而術(shù)后1天、3天、7天、14天和2

24、8天，SOD活性、GSH-PX活性和CAT活性均明顯減低(P＜0.05)，以7天時最明顯(P＜0.05)，28天時仍明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。
　　與VCI模型組小鼠術(shù)后4周相比，2mmol/Kg和5mmol/Kg LiCl無論術(shù)前和術(shù)后給藥，都能明顯降低MDA含量(P＜0.05)、提高SOD活性(P＜0.05)和GSH-PX活性(P＜0.05)。經(jīng)SNK法兩兩比較發(fā)現(xiàn)，采用術(shù)前給藥時，5mmol/Kg效果好;采用術(shù)后給藥

25、時，2mmol/Kg效果好，4組比較而言，以低劑量術(shù)后組最好，但均未達到統(tǒng)計學差異。與VCI模型組小鼠術(shù)后4周相比，2mmol/Kg和5mmol/Kg LiCl無論術(shù)前和術(shù)后給藥，都能不同程度提高CAT活性，但只有在低劑量術(shù)后組達到統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:反復腦IR后1天、3天、7天、14天和28天，氧化應(yīng)激反應(yīng)逐漸增強，引起自由基生成過多或清除能力下降，抑制多種抗氧化物酶活性，導致脂質(zhì)過氧化損傷。2mmol/Kg

26、和5mmol/Kg LiCl無論術(shù)前和術(shù)后給藥，都能通過提高多種抗氧化物酶活性，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少自由基含量，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　第四部分氯化鋰不同劑量和不同時間給藥對血管性認知功能障礙小鼠海馬組織凋亡蛋白和BDNF/CREB信號通路的影響
　　目的:觀察反復腦IR后不同時間點海馬組織Bcl-2、Bax、BDNF蛋白的動態(tài)變化，探討凋亡在反復腦IR中的作用，并檢測術(shù)前或術(shù)后給予2mmol/Kg或5mmol/Kg Li

27、Cl能否通過抑制VCI小鼠凋亡、上調(diào)BDNF和p-CREB等重要蛋白表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　方法:按照第三部分進行分組和模型制備。Western blot法檢測反復腦IR后不同時間點海馬組織Bcl-2、Bax、BDNF蛋白的動態(tài)表達，實時熒光定量PCR(Real Time-qPCR，RT-qPCR)法和Western blot法檢測術(shù)前或術(shù)后給予不同劑量LiCl后Bcl-2、Bax、BDNF、CREB、p-CREB基因或蛋白的

28、表達情況。
　　結(jié)果:Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠術(shù)后不同時間點Bcl-2/Bax比值均降低(P＜0.05)，術(shù)后7天達到最低。各時間點間Bcl-2蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。與假手術(shù)組相比，反復腦IR損傷導致BDNF表達持續(xù)升高，但沒有達到統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　術(shù)前給予5mmol/kg LiCl能明顯上調(diào)反復腦IR導致的Bcl-2/Bax比值降低（上調(diào)35％）(

29、P＜0.05)。術(shù)前和術(shù)后給予2mmol/kg LiCl可將Bcl-2/Bax比值分別上調(diào)9％和17％，但不如高劑量術(shù)前組效果明顯。各組Bcl-2蛋白的表達未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，VCI模型組小鼠海馬組織BDNF mRNA水平明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比，術(shù)前和術(shù)后給予LiCl治療都能明顯增加BDNF mRNA水平(P＜0.05)，在4個LiCl處理組中，以低劑量術(shù)后

30、組增高最明顯。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與VCI模型組相比，術(shù)后2mmol/kg LiCl能明顯增加BDNF蛋白表達（上調(diào)51％，P＜0.05）。術(shù)前2mmol/kg，術(shù)前5mmol/kg和術(shù)后5mmol/kg LiCl處理對BDNF的表達也分別上調(diào)了35％，32％和32％。術(shù)前5mmol/kg LiCl能明顯上調(diào)phospho-CREB Ser133蛋白表達(上調(diào)33％)(P＜0.05)。各組間CREB蛋白表達未見明顯改變(p