養(yǎng)血清腦顆粒改善血管性癡呆大鼠認知功能障礙的機制研究.pdf

1、目的：近年來，癡呆癥逐漸成為全球的主要威脅之一。血管性癡呆（Vasculardementia,VD）是繼阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sDisease,AD）之后第二位最常見的癡呆病因，目前有臨床研究證實養(yǎng)血清腦顆粒可改善VD患者的認知功能，然而，相關的作用機制探索中對神經細胞自噬及其信號轉導通路的調控關注甚少。本實驗通過干預雙側頸總動脈永久性結扎制作VD大鼠模型，觀察VD大鼠術后應用養(yǎng)血清腦顆粒治療對認知功能的改善作用，并進一步探

2、討其是否與JNK/Bcl-2通路介導的神經細胞自噬有關。
　　方法：3月齡250-300g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠為研究對象，采用雙側頸總動脈結扎（bilateralcarotidarteryligation,2-VO）的方法建立VD大鼠模型。實驗隨機分為4組，即假手術組（Sham+Saline）、模型組（2VO+Saline）、養(yǎng)血清腦低劑量治療組（2VO+CG0.4）、養(yǎng)血清腦高劑量治療組（2VO+CG0.

3、8），術后連續(xù)灌胃給藥28天，日一次，假手術組及模型組給予適量的生理鹽水灌胃。
　　連續(xù)給藥28天后進行行為學測試，包括定位航行實驗和空間探索實驗，觀察各組大鼠空間認知能力的變化。水迷宮測試結束后，采用尼氏染色觀察各組大鼠海馬組織病理學變化。丙二醛（Malondialdehyde,MDA）測試盒及總超氧化物歧化酶（Totalsuperoxidedismutase,T-SOD）測試盒檢測各組大鼠海馬組織MDA含量及SOD活性。應用W

4、esternblot檢測各組大鼠海馬組織中JNK、p-JNK、p-bcl-2及自噬相關因子Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白的表達，免疫組織化學方法觀察海馬CA1區(qū)神經元Beclin1和p62陽性細胞數量的變化。
　　結果：
　　1、水迷宮結果
　　1.1定位航行實驗
　　各組大鼠的逃避潛伏期（即入水到找到平臺的時間）隨訓練天數逐漸縮短。第1天，各組大鼠的逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），第2至5天

5、，模型組大鼠較假手術組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）。與模型組大鼠相比，養(yǎng)血清腦治療組大鼠的逃避潛伏期均明顯縮短（第3天P＜0.05，其余P＜0.01）。
　　1.2空間探索實驗
　　與假手術組大鼠相比，模型組大鼠在目標象限（即原平臺所在象限）停留時間百分比比值偏低（P＜0.01），而養(yǎng)血清腦治療組大鼠在目標象限停留時間百分比較模型組大鼠明顯增加（P＜0.05），且高劑量治療組大鼠在目標象限停留時間百分比比值高于低

6、劑量治療組大鼠（P＜0.05）。
　　2、尼氏染色結果
　　假手術組大鼠海馬CA1區(qū)神經元結構完整且排列緊密，胞漿清亮，細胞核清晰可見。與假手術組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經元排列疏松，有缺失現象，部分神經元可見胞體及胞核固縮。養(yǎng)血清腦顆粒治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經元缺失有所減少，仍存在胞核固縮現象。
　　3、MDA含量及SOD活性檢測結果
　　與假手術組大鼠相比，模型組大鼠MDA含量顯著增加(P＜0.0

7、1)，養(yǎng)血清腦治療組大鼠較模型組大鼠MDA含量有所下降(P＜0.01)，高劑量治療組大鼠MDA含量低于低劑量治療組(P＜0.01)。
　　與假手術組大鼠相比，模型組大鼠SOD活性顯著降低(P＜0.01)，養(yǎng)血清腦治療組大鼠較模型組大鼠SOD的活性有所增高(P＜0.01)，高劑量治療組較低劑量治療組大鼠SOD活性更高(P＜0.01)。
　　4、Westernblot結果
　　4.1VD大鼠海馬組織中JNK、p-JNK、p

8、-bcl-2、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的表達：
　　與假手術組大鼠相比，模型組大鼠海馬組織JNK蛋白表達未見明顯差異，p-JNK、p-bcl-2及Beclin1蛋白表達水平明顯增加，LC3-II/I比值升高，p62蛋白表達顯著下降，均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　4.2養(yǎng)血清腦顆粒對VD大鼠海馬組織JNK、p-JNK、p-bcl-2、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的影響：
　　養(yǎng)血清腦

9、治療組大鼠與模型組大鼠相比，JNK蛋白表達未見明顯差異，p-JNK蛋白表達水平下降，且p-bcl-2、Beclin1蛋白表達明顯減少，LC3-II/I比值下降，p62蛋白表達顯著增加，高劑量治療組大鼠較低劑量治療組大鼠變化更明顯（P＜0.01）。
　　5、免疫組織化學結果
　　5.1Beclin1陽性細胞計數統(tǒng)計結果：
　　Beclin1陽性細胞呈棕黃色,于細胞漿表達。與假手術組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細胞

10、數明顯增多（P＜0.01），養(yǎng)血清腦治療組大鼠較模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細胞數減少（P＜0.01）。
　　5.2p62陽性細胞計數統(tǒng)計結果：
　　p62陽性細胞呈棕黃色,于細胞漿表達。與假手術組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細胞數明顯偏少（P＜0.01），養(yǎng)血清腦顆粒治療組大鼠較模型組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細胞數增多（P＜0.05）。
　　結論：養(yǎng)血清腦顆?？梢宰鳛榭寡趸瘎p輕VD大鼠海馬區(qū)氧化損傷，改善慢性腦灌