FGFR3在關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)維持中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是發(fā)生在關(guān)節(jié)中最常見的一種慢性退行性疾病。骨性關(guān)節(jié)炎會(huì)多發(fā)生在負(fù)重關(guān)節(jié)并且造成負(fù)重軟骨的軟骨缺損，最終可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛以及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限的臨床癥狀，病情發(fā)展到最后常常導(dǎo)致患者失去行走能力。目前臨床上能阻止或緩解骨性關(guān)節(jié)炎的措施非常有限。因此，理解骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中的關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)維持的機(jī)制，對(duì)研究治療或者延緩骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展的新型防治措施有重要的意義。
　　成纖維生長(zhǎng)因子(Fi

2、broblast growth factor，F(xiàn)GF)信號(hào)在骨形成和發(fā)育過程中的作用非常關(guān)鍵。成纖維生長(zhǎng)因子(FGFs)家族由22種配體和4種受體組成。成纖維生長(zhǎng)因子(FGFs)通過結(jié)合成纖維生長(zhǎng)因子受體(FGFRs)來發(fā)揮作用。FGFRs在骨形成過程中有特異性的時(shí)空表達(dá)模式。成纖維生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)是在軟骨發(fā)育與軟骨穩(wěn)態(tài)維持中都發(fā)揮重要作用的一種跨膜酪氨酸激酶受體蛋白。FGFR3在骨發(fā)育早期的時(shí)候先在間充質(zhì)凝集中心的軟骨細(xì)胞

3、中表達(dá)，接著在生長(zhǎng)板軟骨和關(guān)節(jié)軟骨中的增殖帶和肥大前帶的軟骨細(xì)胞中表達(dá)。人的FGFR3的基因突變會(huì)導(dǎo)致一系列的骨骼畸形。FGFR3的增強(qiáng)型點(diǎn)突變導(dǎo)致以身材矮小為臨床表現(xiàn)的骨骼發(fā)育不良，包括致死性軟骨發(fā)育不良(thanatophoric dysplasia，TDⅠ/Ⅱ)，軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia，ACH)等;而人的FGFR3的失活性點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致CATSHL綜合征，即聽力喪失、高身材和屈曲指。FGFR3被認(rèn)為是軟骨內(nèi)成骨的

4、發(fā)育過程中的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，但FGFR3信號(hào)在關(guān)節(jié)軟骨中的直接作用還需要進(jìn)一步研究。
　　構(gòu)建了FGFR3軟骨特異性誘導(dǎo)敲除和增強(qiáng)小鼠的DMM手術(shù)誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎模型，來研究FGFR3在關(guān)節(jié)軟骨中穩(wěn)態(tài)維持的作用和機(jī)制。接著，為了進(jìn)一步尋找治療骨性關(guān)節(jié)炎的生物因子，我們通過觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射FGF9到DMM手術(shù)誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，來研究FGF9是否可能成為靶向調(diào)節(jié)FGFR3的骨性關(guān)節(jié)炎的新型治療因子。
　　方法：
　　

5、第一部分:
　　1.建立成年期可誘導(dǎo)條件性敲除或增強(qiáng)fgfr3小鼠，即在1月或2月齡的同窩Fgfr3f/f; Col2a1-CreERT2(Fgfr3 cKO)小鼠和Fgfr3f/f(Cre-ne gative)小鼠，或1月或2月齡的同窩Fgfr3K644E/neo;Col2a1-CreERT2(Fgfr3 cAct)小鼠和Fgfr3K644E/neo(Cre-negative)小鼠，同時(shí)腹腔內(nèi)注射1mg/10g/天Tamoxif

6、en(TM)腹腔內(nèi)注射5天。對(duì)小鼠行DMM(Destabilization of the Medial Meniscus)手術(shù)。
　　2.通過藏紅-固綠染色法觀測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并且使用OARSI(Osteoarthritis research Society International)推薦的評(píng)測(cè)方法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行評(píng)分;通過免疫組織化學(xué)染色法觀測(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織的FGFR3、CollagenⅡ、CollagenⅩ、MMP13

7、、AggrecanNeo的表達(dá)情況。
　　3.建立老年期Fgfr3ACH/+小鼠自發(fā)OA模型，并在6月齡、12月齡、20月齡分別取材，通過藏紅-固綠染色法觀測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)，通過免疫組化染色法觀察小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中CollagenⅩ和MMP13的表達(dá)情況。
　　4.取Fgfr3f/f; Col2a1-CreERT2(Fgfr3 cKO)和Fgfr3f/f(Cre-negative)小鼠的股骨頭的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行體外組織塊

8、培養(yǎng)，然后用4-hydroxytamoxifen處理，接著用IHH信號(hào)阻斷劑(GDC0449，SMOi)處理，并提取RNA然后反轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Ihh、Gli、Runx2、Mmp13、Adamts5、Col10a1、Col2a1和Aggrecan的表達(dá)。
　　第二部分:
　　1.為了研究FGF9在體內(nèi)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的作用，我們?cè)谛∈驞MM關(guān)節(jié)炎模型中注射FGF9。先對(duì)小鼠行DMM手術(shù)，接著在DMM手術(shù)后2周注射F

9、GF9。先把FGF9溶液（2.5μg粉劑溶解在5μl生理鹽水中）與纖維蛋白原溶液混合(3μg/μl)后注射在關(guān)節(jié)腔中，接著注射1μl凝血酶(0.2 unit)使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，這樣就可以使FGF9緩慢釋放到關(guān)節(jié)腔內(nèi)。在手術(shù)后第8周和12周時(shí)處死小鼠，取小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織切片觀察;
　　2.建立人關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)模型，研究了外源性FGF9的處理對(duì)白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的人關(guān)節(jié)軟骨退變的

10、作用，并且通過藏紅固綠染色法觀察人關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，接著再通過免疫組化染色法觀察人關(guān)節(jié)軟骨的collagenⅡ，collagenⅩ和MMP13的表達(dá)情況;通過WB檢測(cè)人關(guān)節(jié)軟骨aggrecan和MMP13的蛋白表達(dá)變化;
　　4.通過Micro-CT掃描重建，觀察FGF9關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的變化情況，通過藏紅固綠染色法以及阿爾新藍(lán)/蘇木精/伊紅染色法觀察小鼠的膝關(guān)節(jié)中組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化。
　　5.通過免疫組織化

11、學(xué)染色法觀察FGF9注射后小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的collagenⅡ，collagenⅩ， MMP13以及Cleaved caspase-3的表達(dá)情況，以及在骨贅形成處CollagenⅡ，PCNA和SOX9的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:FGFR3抑制成年小鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展
　　1.成年小鼠軟骨特異性敲除Fgfr3后關(guān)節(jié)軟骨降解過程加速。
　　2.成年小鼠軟骨特異性敲除Fgfr3后CollagenⅡ表達(dá)

12、降低，CollagenⅩ、MMP13和AggrecanNeo表達(dá)升高。
　　3.成年小鼠軟骨特異性增強(qiáng)Fgfr3后關(guān)節(jié)軟骨降解過程減緩。
　　4.Fgfr3ACH/+小鼠其老年自發(fā)OA的進(jìn)程減緩。
　　5.成年小鼠軟骨特異性增強(qiáng)Fgfr3后CollagenⅩ、MMP13表達(dá)降低，老年Fgfr3ACH/+小鼠CollagenⅩ、MMP13表達(dá)降低。
　　6.體外關(guān)節(jié)軟骨組織中敲除Fgfr3后，IHH信號(hào)和Runx2

13、表達(dá)升高，而阻斷IHH信號(hào)會(huì)抑制已上調(diào)表達(dá)的Runx2、Mmp13的表達(dá)。
　　第二部分:外源性FGF9緩解關(guān)節(jié)軟骨損傷后引起的骨性關(guān)節(jié)炎
　　1.關(guān)節(jié)內(nèi)注射FGF9延緩小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)軟骨降解。DMM手術(shù)加關(guān)節(jié)腔內(nèi)FGF9治療組的股骨和脛骨的評(píng)分其最高分和總分都顯著低于DMM手術(shù)加空白鹽水的治療組;而DMM誘導(dǎo)并注射FGF9后，MMP13和CollagenⅩ的表達(dá)相比對(duì)照降低。
　　2.FGF9對(duì)炎癥環(huán)境中的人

14、關(guān)節(jié)軟骨退變有保護(hù)作用，外源性FGF9處理后能明顯導(dǎo)致IL-1β處理后的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞其MMP13的表達(dá)降低、aggrecan的表達(dá)增加。
　　3.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射FGF9促進(jìn)DMM手術(shù)后的關(guān)節(jié)周圍骨贅的形成。FGF9處理后能顯著增加DMM手術(shù)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)附近形成的骨贅的大小;在小鼠8周及12周時(shí)注射FGF9能明顯提高DMM誘導(dǎo)術(shù)后的關(guān)節(jié)周圍骨贅其大小。
　　4.FGF9促進(jìn)關(guān)節(jié)周圍骨贅形成過程中的細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞的分化。在DM