miR-99a靶向調控FGFR3抑制上皮性卵巢癌細胞增殖的機制研究.pdf

1、根據(jù)2014年癌癥統(tǒng)計，卵巢癌是美國女性第五位致死的病因，全年發(fā)病人數(shù)21980，但死亡人數(shù)卻在14270。由于缺乏特異性的腹盆腔癥狀和敏感標記物使得卵巢癌的早期診斷非常困難，當最終確診時絕大多數(shù)患者都已經進展為晚期。因此，卵巢癌的死亡率居高不下，預后極差，5年預期總生存率往往不到30％。為了早期診斷及改善卵巢癌的預后，非常迫切需要尋找能夠輔助早期診斷卵巢癌，并有助于選擇最佳的、個性化的治療方案的腫瘤預測標記物。
　　MicroR

2、NAs(miRNAs)是近年來的研究熱點，它是一組短鏈、非編碼的單鏈RNAs，直接作用于靶向mRNA的非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)的堿基修復，成為了新的轉錄后調節(jié)器。研究表明，miRNAs參與許多生理過程，譬如細胞循環(huán)、代謝作用、血管發(fā)生、分化、細胞調亡等。并且miRNAs的異常表達可能與腫瘤有關，其通過調節(jié)基因和信號途徑參與腫瘤的發(fā)生、進展、轉移和耐藥。最為可喜的是，已有證據(jù)表明miRNA在細胞質中產生

3、，不僅可以影響細胞的功能，也可以釋放入血液，來發(fā)揮調節(jié)遠處靶基因的功能。與其他循環(huán)中的核酸相比，循環(huán)中的miRNA水平更加穩(wěn)定、具有可重復性和持續(xù)性。循環(huán)中的miRNA在多種實體瘤中被成功評估，可作為新的無創(chuàng)性的疾病早期診斷標記物。
　　在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)中，miR-15a，miR-16，miR-31，miR-200家族等miRNAs表達上調，而let-7， miRNA-3

4、4 a/b/c，miRNA-100、miR-199a/214、miR-99a等miRNAs表達下調。其中的miR-99a位于與多種疾病有關的21q21上，研究表明miR-99a在肝細胞癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌以及膀胱癌中均表達異常。已有研究通過miRNA微芯片技術檢測，發(fā)現(xiàn)miR-99a在正常卵巢組織和卵巢癌中表達存在差異。然而，上皮性卵巢癌中miR-99a是否在血清中異常表達及其在卵巢癌中的生物學功能仍不清楚。因此，有必要驗證m

5、iR-99a在卵巢癌，特別是上皮性卵巢癌中的作用。在本研究中，我們嘗試檢測miR-99a在上皮性卵巢癌臨床標本和細胞系中的表達，此外，通過體外研究纖維細胞生長因子受體3（Fibroblast growth factor receptor3，F(xiàn)GFR3），來推測miR-99a在上皮性卵巢癌中的調控機制。
　　第一部分:miR-99a在上皮性卵巢癌患者血清及其卵巢癌組織中的表達
　　目的:檢測miR-99a在上皮性卵巢癌患者血清

6、、卵巢癌組織及卵巢癌細胞中的表達，探討miR-99a作為上皮性卵巢癌血清標記物的可能性。
　　方法:1.留取15例卵巢癌患者及3例正常志愿者血液樣本，采用實時熒光定量PCR檢測血清中miR-99a的表達。2.留取手術切除的組織標本，同樣的方法檢測miR-99a在卵巢癌組織中的表達情況。3.同法檢測卵巢癌細胞株SKOV3和正常卵巢組織細胞株OSE中miR-99a的表達。
　　結果:1.卵巢癌患者的血清中miR-99a的表達水平

7、下調。2.卵巢癌患者的卵巢癌組織中miR-99a的表達水平下調。3.卵巢癌細胞系中miR-99a表達水平下調。
　　結論:1.miR-99a在EOC中的表達下調，提示miR-99a可能是卵巢癌的一種抑癌基因。2.在卵巢癌患者血清中miR-99a表達下調，有望成為早期診斷上皮性卵巢癌的新的生物學標記物。
　　第二部分:miR-99a靶點基因FGFR3的預測及驗證
　　目的:通過生物學信息法預測miR-99a調控的靶基因，

8、在卵巢癌細胞中進一步驗證miR-99a如何作用于靶基因，從而為進一步闡明卵巢癌發(fā)病機制提供理論依據(jù)。
　　方法:1.使用miRNA靶標預測軟件數(shù)據(jù)庫(PicTar、TargetScan、miRanda)尋找初步預測的靶基因，并將初測的基因進行RNA雜交(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)。2.采用RT-PCR和Westem Blot法檢測了OSE細胞和SKOV3

9、細胞中FGFR3的mRNA和蛋白表達水平，從而來驗證FGFR3基因是否與EOC相關。3.構建FGFR3的3'-UTR區(qū)的熒光素酶表達質粒pGL3-FGFR3，與miR-99a共同轉染細胞，相對于無處理組(No-treated)和突變組(pGL3-mut)，來觀察miR-99a對pGL3-FGFR3的熒光素酶活性的影響，進而判斷miR-99a是否可直接調控FGFR3的3'-UTR區(qū)。4.為了研究miR-99a對FGFR3的表達水平的影響，

10、我們在SKOV3細胞中瞬時轉染miR-99a，通過qRT-PCR檢測miR-99a轉染組細胞中miR-99a的表達水平升高。然后，我們通過RT-PCR、qRT-PCR及Western Blot檢測miR-99a過表達對FGFR3的mRNA和蛋白表達水平的影響。進一步驗證兩者的關系。
　　結果:1.通過生物學信息法分析預測FGFR3是miR-99a的靶基因。2.FGFR3在SKOV3細胞中相比OSE細胞的表達水平顯著升高。3.miR

11、-99a調控FGFR3的3'-UTR區(qū)。4.miR-99a下調FGFR3的mRNA和蛋白表達水平。
　　結論:1.FGFR3是miR-99a的靶基因。2.miR-99a可下調卵巢癌細胞中FGFR3的表達。這可能是卵巢癌發(fā)生的分子生物學機制之一。
　　第三部分:miR-99a調控靶基因FGFR3對卵巢癌細胞增殖水平的影響
　　目的:探討miR-99a對卵巢癌細胞的影響;敲減FGFR3對卵巢癌細胞SKOV3增殖的影響。

12、r>　　方法:1.采用CCK-8法檢測miR-99a過表達對SKOV3細胞增殖的影響。2.采用siRNA技術是將卵巢癌細胞中的FGFR3的表達降低。3.采用CCK-8法檢測轉染siRNA靶向敲減FGFR3后對SKOV3細胞增殖的影響。
　　結果:1.miR-99a過表達抑制卵巢癌細胞增殖。2.siRNA有效靶向敲減FGFR3表達后，卵巢癌細胞增殖被顯著抑制。
　　結論:miR-99a通過靶向調節(jié)FGFR3抑制卵巢癌細胞的細胞