SIVmac239致恒河猴免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌缺陷及免疫Ⅰ干預(yù)研究.pdf

1、全球和我國的艾滋病防控形勢依然嚴(yán)峻。從機理研究和臨床表現(xiàn)顯示,艾滋病是一種復(fù)雜的、涉及多系統(tǒng)病變的綜合征,其免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)的綜合發(fā)病機制研究越來越受到重視。如何發(fā)揮中醫(yī)藥在艾滋病防治中的作用?是目前中醫(yī)藥科研工作者急需解決的重大課題。中醫(yī)認為,艾滋病具有外感疫毒之邪、多臟腑受損等特點,毒邪是艾滋病的直接致病因為,元氣受損、五臟俱虛是艾滋病的主要病機特點,治療以健脾益氣、清熱解毒、活血化瘀、益氣養(yǎng)陰等方法為主。以益氣解毒為治則

2、的經(jīng)驗方免疫Ⅰ治療艾滋病具有較好的臨床療效。
　　 為了進一步研究艾滋病的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的發(fā)病機制,并觀察免疫Ⅰ的作用,本研究采用中國恒河猴16只,雄性,按體重隨機分為正常組(normal,n=4),感染組(n=12)。感染組采用靜脈感染SIVmac239建立中國恒河猴艾滋病模型,感染后2周經(jīng)Taqman探針熒光定量RT—PCR檢測血漿SIVRNA確認感染成功。感染后2個月,根據(jù)CD3+CD4+絕對計數(shù)將感染組隨機分為模

3、型組(model,n=6)和治療組(ImmuneⅠ,n=6)。治療組采用灌胃的方法給予免疫Ⅰ,每天1次,每周6天,給藥劑量為0.58g／kg,相當(dāng)于成人常用量的2.9倍。3月為1療程,共觀察2個療程。安樂死后取材。
　　 本研究觀察指標(biāo)包括:
　　 (1)一般情況。包括體重、食欲、口腔黏膜、腹瀉、咳嗽、舌苔、大便、體溫、生化指標(biāo)等；
　　 (2)采用流式細胞儀測定外周血CD3+CD4+、CD3+CD8的絕對計數(shù)和

4、CD3+CD4+／CD3+CD8比例；
　　 (3)采用流式細胞儀測定外周血CD4+CD25+Foxp3+的比例:
　　 (4)采用Taqman探針實時熒光定量RT-PCR法測定血漿中SIVRNA病毒載量;
　　 (5)感染前、感染后2個月、治療1療程時,無菌手術(shù)取腹股溝淋巴結(jié)或腋窩淋巴結(jié)活檢,判斷淋巴結(jié)的增生、退變、耗竭程度；
　　 (6)HE染色觀察胸腺、腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟等

5、免疫系統(tǒng)病理變化:Kj-67免疫組化顯示淋巴結(jié)新生細胞的數(shù)量；
　　 (7)HE染色觀察延腦、橋腦、中腦、大腦、下丘腦、小腦、胸腰神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)系統(tǒng)病理變化,采用分級方法計算病變積分,并計算各神經(jīng)核神經(jīng)細胞總數(shù)及有核神經(jīng)細胞數(shù)。
　　 (8)HE染色觀察垂體、腎上腺、睪丸及副睪、甲狀腺、松果體等內(nèi)分泌系統(tǒng)病理變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)中國恒河猴感染SIVmac239后,精神變差、體重下降、食欲降

6、低、口腔黏膜潰瘍、口腔黏膜微循環(huán)變差、腹瀉、咳嗽、發(fā)熱等并發(fā)癥,該癥狀與體征與艾滋病的虛損、虛勞、疫毒基本一致。免疫I治療2個療程后,體重增加,肺部感染、腹瀉、發(fā)熱等并發(fā)癥發(fā)生率下降,口腔黏膜微循環(huán)改善。SIVmac239感染后ALB、GGT、CHO、HDL升高,免疫Ⅰ治療2個療程能明顯降低ALB、GGT,但對CHO、HDL無明顯影響。
　　 (2)感染SIVmac239后CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)下降,CD3+CD4+

7、／CD3+CD8+逐漸下降,與人感染HIV后的表現(xiàn)基本一致。免疫Ⅰ治療2個療程可以明顯升高CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)和CD3+CD4+／CD3+-CD8+比值。
　　 (3)感染SIVmac239后1-2周,SIVRNA病毒載量達到頂峰(107copies／ml左右),4周后達到較穩(wěn)定的平臺期(104～106copies／ml),與HIV病毒在人體內(nèi)感染復(fù)制的過程較為相似。但免疫Ⅰ治療2個療程后SIVRNA病毒載量無明顯

8、降低。
　　 (4)淋巴結(jié)活檢顯示,感染前,淋巴結(jié)呈初始狀態(tài),未經(jīng)受抗原刺激,表現(xiàn)為淋巴濾泡中等大小,生發(fā)中心不明顯。SIVmac239感染后2月,淋巴濾泡增生,呈輕度退變(±～+),無耗竭。生發(fā)中心擴大,明區(qū)細胞活躍,髓竇內(nèi)含淋巴細胞和單核-巨噬細胞。感染后5月,淋巴濾泡增生加重,生發(fā)中心可見免疫復(fù)合物沉積,引起局部細胞的退變(±～++),血管內(nèi)皮細胞腫脹,血管增生,淋巴細胞浸潤。與模型組相比,治療組活檢淋巴結(jié)病變程度相對較輕

9、。
　　 (5)試驗終末期尸解后淋巴結(jié)病理檢測發(fā)現(xiàn):正常組輕度退變,2例(±～+),無耗竭。所有感染組恒河猴淋巴結(jié)增生(++～+++),3例退變(++～+++),3例耗竭(++～+++)。淋巴結(jié)生發(fā)中心萎縮甚至消失,副皮質(zhì)萎縮。微小血管出現(xiàn)淋巴細胞、巨噬細胞浸潤,引發(fā)局部微循環(huán)障礙,致部分或全部淋巴結(jié)生發(fā)中心萎縮及消失。隨著淋巴竇道的運行方向,淋巴組織細胞變性、溶解、消失,出現(xiàn)大量空泡,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)溶解消失。與模型組相比,治療組恒河

10、猴淋巴結(jié)增生(++～+++),退變3例,退變程度較模型組減輕(±～+),無耗竭,生發(fā)中心明區(qū)的免疫復(fù)合物沉積較少,未見與淋巴竇道運行相關(guān)的淋巴組織細胞變性、溶解、消失。
　　 (6)淋巴結(jié)Ki-67染色顯示SIV感染后10個月時生發(fā)中心的新生細胞較少,呈散在分布。免疫Ⅰ治療后,生發(fā)中心集中分布了較豐富的Ki-67陽性細胞,新生細胞較多。
　　 (7)SIVmac239感染后,胸腺明顯萎縮4例,殘余2例。胸腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)萎

11、縮。哈氏小體停止發(fā)育,未角化。脾小體萎縮、退變,髓竇內(nèi)含較多淋巴細胞和網(wǎng)狀細胞。免疫Ⅰ治療后,能延緩胸腺和脾臟的病變。
　　 (8)中國恒河猴感染SIVmac239后,脊髓、延腦、橋腦、中腦、大腦、小腦、神經(jīng)節(jié)各核團出現(xiàn)不同程度的細胞減少、固縮,出現(xiàn)無核細胞,紅染加重,細胞質(zhì)變性,細胞核、核仁、核仁小體消失,部分染色質(zhì)呈溶解狀。神經(jīng)細胞軸突變短甚至消失。延腦圍管浸潤、膠質(zhì)細胞小結(jié)、脫髓鞘改變較嚴(yán)重。舌下神經(jīng)核有核細胞數(shù)量明顯減少

12、。神經(jīng)節(jié)的病變程度與慢性腹瀉的發(fā)生呈相關(guān)性。慢性腹瀉的恒河猴神經(jīng)節(jié)病變較未發(fā)生慢性腹瀉恒河猴明顯減輕。免疫Ⅰ治療后,對神經(jīng)系統(tǒng)的多個神經(jīng)核具有一定程度的保護作用,并能明顯提高舌下神經(jīng)核有核細胞數(shù)量,輕度提高迷走神經(jīng)核和紅核的有核神經(jīng)細胞數(shù)量。
　　 (9)SIVmac239感染后,垂體、腎上腺、甲狀腺、松果體、睪丸及附睪出現(xiàn)了不同程度的病變。垂體嗜酸性細胞減少,炎癥細胞浸潤。模型組恒河猴大部分腎上腺帶狀層細胞為蛋白質(zhì)胞漿,網(wǎng)狀層

13、排列不整齊,較多髓質(zhì)嗜鉻細胞排空(4例／6例)。5例模型組恒河猴睪丸生精小管中僅見精原細胞,未見精母細胞和精子,副睪內(nèi)未見精子,另1例可見少量精子,表現(xiàn)為突出的成精功能障礙。甲狀腺腺泡大小不等,膠體著色深淺不一。松果體細胞萎縮,細胞間纖維組織增加,細胞排空明顯,分泌功能較差。免疫Ⅰ治療后,垂體嗜酸性細胞減少的程度較輕,炎癥細胞浸潤不明顯。腎上腺帶狀層細胞大部分為類固醇胞漿(4例／6例),蛋白質(zhì)胞漿較少(2例／6例),嗜鉻細胞比較飽滿；睪

14、丸生精小管中可見精原細胞、精母細胞及少量精子,具有部分成精功能。免疫Ⅰ能明顯減輕垂體、腎上腺及睪丸的病變程度。
　　 結(jié)論及意義:
　　 中國恒河猴感染SIVmac239后,表現(xiàn)了與人艾滋病較類似的一般狀況。CD3+CD4+T淋巴細胞和CD3+CD4+／CD3+CD8+比值逐漸下降。感染后1-2周,SIVRNA達到頂峰,4周后達到較穩(wěn)定的平臺期。感染后淋巴結(jié)的增生逐漸加重,免疫復(fù)合物沉積,淋巴濾泡的退變與耗竭,淋巴組織的

15、耗竭與髓竇的分布有關(guān)。胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)萎縮,哈氏小體停止角化。脾小體變小,髓竇內(nèi)含淋巴細胞和單核.巨噬細胞。脊髓、延腦、橋腦、中腦、大腦、小腦、神經(jīng)節(jié)各核團出現(xiàn)不同程度的細胞減少、固縮,出現(xiàn)無核細胞,紅染加重,細胞質(zhì)變性,細胞核、核仁、核仁小體消失,染色質(zhì)呈溶解狀。神經(jīng)細胞軸突變短甚至消失,延腦出現(xiàn)圍管浸潤、膠質(zhì)細胞小結(jié)、脫髓鞘等嚴(yán)重病變。慢性腹瀉與恒河猴神經(jīng)節(jié)病變程度呈正相關(guān)。垂體和腎上腺分泌功能下降,睪丸生精小管成精功能障礙,松果體和

16、甲狀腺功能輕度減退。猴艾滋病綜合表現(xiàn)為免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)功能缺陷。
　　 免疫Ⅰ治療2個療程后,能明顯改善恒河猴的一般狀況,使CD3+CD4+絕對計數(shù)、CD3+CD4+／CD3+CD8+比值升高。免疫Ⅰ能改善恒河猴淋巴結(jié)、胸腺、脾臟病變,使淋巴結(jié)新生細胞增多,可能是通過調(diào)節(jié)SIV引起的自身免疫反應(yīng)而發(fā)揮作用的。對神經(jīng)系統(tǒng)的多個神經(jīng)核具有一定的保護作用,并能明顯提高舌下神經(jīng)核有核細胞數(shù)量,輕度提高迷走神經(jīng)核和紅核的有核神經(jīng)細胞

17、數(shù)量。對內(nèi)分泌系統(tǒng)的保護作用主要體現(xiàn)在垂體、腎上腺和睪丸。免疫Ⅰ具有較好的調(diào)節(jié)猴艾滋病免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)功能缺陷的作用。
　　 本研究從免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌多系統(tǒng)缺陷的獨特角度探討恒河猴艾滋病的發(fā)病機制,較早提出了SIVmac239感染對恒河猴下丘腦-垂體-腎上腺-性腺軸具有影響,進一步拓展了艾滋病發(fā)病機制的內(nèi)涵,具有較好的理論意義和創(chuàng)新性。另一方面,本研究免疫Ⅰ組方較新穎,對恒河猴艾滋病具有多系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用,具有較好的臨床意