內(nèi)毒素拮抗肽抑制脂多糖誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)及其機制研究.pdf

1、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，也稱為內(nèi)毒素(endotoxin)是內(nèi)毒素血癥(endotoxemia)及膿毒癥(sepsis)最主要的致病因子。LPS致病作用的關(guān)鍵在于其通過激活Toll樣受體4(toll like receptor4，TLR4)跨膜信號通路，活化宿主免疫細胞，促進細胞因子和炎癥介質(zhì)的過度釋放，導(dǎo)致機體組織損傷、多器官衰竭甚至死亡。因此，抑制TLR4跨膜信號通路的激活是防治LPS誘導(dǎo)的過度炎癥反

2、應(yīng)的有效策略。
　　 LPS誘導(dǎo)TLR4跨膜信號通路的激活受到多種信號蛋白/受體的調(diào)控，其中脂多糖結(jié)合蛋白(LPS-binding protein，LBP)、CD14、髓樣分化蛋白-2(Myeloid differentiationprotein-2，MD-2)和TLR4是最重要的調(diào)控分子。LBP是介導(dǎo)LPS與靶細胞表面受體CD14結(jié)合的重要載體蛋白，可催化放大LPS誘導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)100～1000倍，是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主

3、要原因之一。而MD-2則被認為是LPS激活TLR4跨膜信號通路所必需的受體分子，在該通路調(diào)控過程中發(fā)揮著不可替代的作用。對于TLR4跨膜信號通路活化的拮抗研究，LBP和MD-2可能是其中最為合理的關(guān)鍵治療靶點。
　　 基于此，本研究擬在既往工作基礎(chǔ)上，分別以TLR4跨膜信號通路中兩個最為關(guān)鍵的調(diào)控蛋白(載體LBP和受體MD-2)為目標(biāo)分子，利用生物信息學(xué)分析蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，設(shè)計構(gòu)建新的針對LBP和MD-2的小分子內(nèi)毒素拮抗

4、肽，并對其體外和體內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)及可能機制進行初步研究，以期獲得具有高拮抗LPS活性的內(nèi)毒素拮抗肽，為膿毒癥的防治提供有益的探索和嘗試。
　　 主要實驗方法與結(jié)果：
　　 1.以TLR4跨膜信號通路的關(guān)鍵載體LBP第91-108位氨基酸殘基組成的多肽，即內(nèi)毒素結(jié)合肽(endotoxin binding peptide，EBP)為親代模板，基于增加EBP的疏水性、正電荷數(shù)，構(gòu)建合理的兩親性小分子多肽的設(shè)計原

5、則，通過氨基酸替換構(gòu)建了一組內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體(mutants of endotoxin binding peptide，mEBPs)；采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成EBP、mEBPs以及對照肽(EBP scrambled peptide，ESP)，并利用顯色基質(zhì)鱟試劑法(CE-TAL)從中篩選獲得1條比EBP中和LPS活性更強的突變體mEBP9(氨基酸序列為：WKVRASFFKLKGSFKVSV)。
　　 2.體

6、外活性檢測結(jié)果顯示mEBP9呈劑量依賴性中和LPS活性，并可競爭性抑制rLBP與LPS結(jié)合，抑制效應(yīng)明顯強于EBP(P<0.05)。進一步的細胞學(xué)實驗顯示mEBP9可顯著抑制人THP-1細胞(經(jīng)豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)誘導(dǎo)分化為成熟巨噬細胞)和小鼠RAW264.7細胞對LPS刺激的過度反應(yīng)，明顯降低效應(yīng)細胞TNFG-α和IL-6分泌及TNF-α mRNA表達水平(P<0.05)

7、；且對該兩種細胞生長均無可見的毒副作用。
　　 3.體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)評估顯示mEBP9對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型具有比EBP更好的保護效應(yīng)，可明顯降低LPS刺激24h后小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)內(nèi)的中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量、總蛋白及TNF-α水平(P<0.05)，明顯減少小鼠肺部支氣管周圍和肺泡間隔內(nèi)的炎性細胞浸潤。而且，mEBP9還可明顯降低燒傷合并內(nèi)毒素血癥

8、模型小鼠48h死亡率，降低血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST活性及TNF-α水平(P<0.05)。
　　 4.針對TLR4跨膜信號通路的必需受體MD-2，在分析其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系基礎(chǔ)上，設(shè)計構(gòu)建了1條新的源于MD-2蛋白本身的模擬肽(MD-2 mimetic peptide，MDMP)，其氨基酸序列為：CHGHDDDYSFCFSFEGILFPKGHYR，由理論上推測的MD-2蛋白的兩個獨特的功能結(jié)構(gòu)域組成：MD-2與TLR4的結(jié)合域(Cy

9、s95-Cys105)及MD-2與LPS的結(jié)合域(Phe119-Lys132)。
　　 5.ELISA直接結(jié)合及鱟試劑中和試驗顯示，經(jīng)Fmoc固相合成的MDMP不僅可與LPS結(jié)合，還呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的LAL活化，而對照肽(MD-2 scrambledpeptide，MDSP)則無類似效應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)用MDMP預(yù)處理可明顯減弱RAW264.7細胞對LPS刺激的反應(yīng)，包括下調(diào)RAW264.7細胞表面TLR4-MD-2復(fù)

10、合體的表達、抑制FITC-LPS與RAW264.7細胞的結(jié)合、降低MAPKs和NF-κB信號通路的活化及TNF-α分泌水平(P<0.05)。
　　 6.在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中，MDMP預(yù)處理可顯著減少LPS刺激24h后支氣管肺泡灌洗液(BALF)內(nèi)中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量、總蛋白和TNF-α分泌水平(P<0.05)；并減少小鼠肺組織的炎性細胞浸潤。MDMP預(yù)處理對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷亦具有保護效應(yīng)

11、，可顯著降低模型小鼠死亡率、減少肝組織內(nèi)炎癥反應(yīng)和肝細胞壞死、降低血清ALT、AST活性和TNF-α水平(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用生物信息學(xué)技術(shù)對LBP的LPS結(jié)合位點肽段進行選擇性突變和改建，成功篩選獲得比親代EBP拮抗LPS活性更強的突變體mEBP9。活性檢測分析顯示，mEBP9可能是通過直接中和LPS及競爭性阻斷LBP與LPS結(jié)合，從而在體內(nèi)外抑制LPS誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)。該研究結(jié)果為以抑制L

12、BP的催化放大效應(yīng)為靶標(biāo)的膿毒癥防治策略提供了新的實驗依據(jù)。
　　 2.基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系而設(shè)計構(gòu)建的MD-2模擬肽(MDMP)可在體外和體內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)，MDMP的這種拮抗效應(yīng)可能與其中和LPS活性、下調(diào)TLR4-MD-2復(fù)合體表達以及降低MAPKs和NF-κB信號激活有關(guān)，提示針對MD-2的拮抗治療是抑制TLR4跨膜信號通路激活的有效途徑之一，為膿毒癥的防治提供了新的研究思路。
　　 3.上述