FHL1調(diào)控FAK信號(hào)通路在主動(dòng)脈夾層形成中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　主動(dòng)脈中膜退化和血管平滑肌細(xì)胞功能失調(diào)是引起主動(dòng)脈夾層的主要原因，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白four and halfLIM domain1(FHL1)蛋白在主動(dòng)脈夾層中表達(dá)下調(diào)，而且下調(diào)其表達(dá)抑制了主動(dòng)脈血管平滑肌的增殖。FAK(focal adhesion kinase)信號(hào)通路介導(dǎo)體內(nèi)多信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、遷移和信號(hào)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，F(xiàn)HL1間接參與了FAK介導(dǎo)的整合素信號(hào)通路，并且在某些疾病模型中與F

2、AK通路的相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用。本課題通過(guò)檢測(cè)FHL1與FAK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及其調(diào)節(jié)細(xì)胞功能等方面展開(kāi)研究，明確了FHL1與FAK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)主動(dòng)脈壁重構(gòu)中相關(guān)關(guān)系，探討了FHL1參與夾層發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。
　　研究方法:
　　收集正常主動(dòng)脈和夾層患者的主動(dòng)脈組織，常規(guī)提取組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blotting，WB）實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)并比較FHL1和Paxillin蛋白兩組主動(dòng)脈脈

3、組織中的表達(dá)。再利用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）明確FAK相關(guān)蛋白在主動(dòng)脈中的分布以及FHL1蛋白與Paxillion蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　構(gòu)建并包裝調(diào)控FHL1蛋白表達(dá)的腺病毒轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(humanaorta vascular smooth muscle cell，HASMC)，采用實(shí)時(shí)定量PCR(Q-RT-PCR)檢測(cè)病毒對(duì)FHL1 mRNA水平的調(diào)控，并利用Western

4、 blotting測(cè)定靶向調(diào)控FHL1表達(dá)的腺病毒對(duì)FHL1蛋白的調(diào)控效果;于此同時(shí)，采用CCK-8檢測(cè)過(guò)表達(dá)FHL1蛋白與使用FAK抑制劑下調(diào)FAK表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。同樣，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)FHL1蛋白與使用FAK抑制劑下調(diào)FAK表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　構(gòu)建并包裝下調(diào)FHL1蛋白表達(dá)的腺相關(guān)病毒，通過(guò)尾靜脈注射注入小鼠體內(nèi)，用以轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和Western blotting實(shí)驗(yàn)分別在mR

5、NA水平和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)腺相關(guān)病毒下調(diào)FHL1表達(dá)的效果。同時(shí)構(gòu)建小鼠主動(dòng)脈夾層模型，通過(guò)觀察小鼠死亡率、夾層發(fā)生率和主動(dòng)脈中膜的厚度，驗(yàn)證FHL1對(duì)夾層發(fā)生的影響
　　結(jié)果:
　　FHL1蛋白與Paxillin蛋白在人體主動(dòng)脈組織標(biāo)準(zhǔn)中均表達(dá)低與正常人，而且Paxillin蛋白與FHL1蛋白均定位于主動(dòng)脈中膜層和主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞質(zhì)中。
　　靶向調(diào)控FHL1的腺病毒能有效調(diào)控mRNA水平及蛋白表達(dá)，CCK8檢測(cè)上

6、調(diào)FHL1表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而下調(diào)FAK表達(dá)可以抑制FHL1的促細(xì)胞增殖效應(yīng)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞增殖結(jié)果相似，下調(diào)FAK表達(dá)可逆反FHL1蛋白的促細(xì)胞遷移效應(yīng)。
　　靶向調(diào)控干擾FHL1表達(dá)的腺相關(guān)病毒，降低了小鼠主動(dòng)脈FHL1的mRNA水平和下調(diào)了FHL1的蛋白表達(dá)。FHL1下調(diào)組小鼠的死亡率和夾層發(fā)生率都顯著高于對(duì)照組，而且其中膜厚度也較對(duì)照組明顯增加。
　　結(jié)論:
　　FHL1參與主動(dòng)脈血管重塑過(guò)程可能