miR-22在主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制中的作用及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:明確miR-22對(duì)血管平滑肌細(xì)胞作用及其在主動(dòng)脈夾層發(fā)病中的作用及調(diào)控機(jī)制。
　　方法:1.在符合倫理要求前提下，收集正常捐獻(xiàn)者主動(dòng)脈組織8例，主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈10例;提取主動(dòng)脈組織總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)miR-22表達(dá)含量;主動(dòng)脈組織冰凍包埋切片，通過(guò)miRNA熒光原位雜交和細(xì)胞免疫熒光共定位檢測(cè)miR-22在主動(dòng)脈組織中分布差異;2.轉(zhuǎn)基因Tg(Flik1:egfp)斑馬魚(yú)系胚胎單細(xì)胞時(shí)期顯微注射MO-22，

2、于注射后斑馬魚(yú)20phf、24phf、30phf收集斑馬魚(yú)胚胎各20枚提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)miR-22表達(dá)變化;分別于斑馬魚(yú)24phf、30phf在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)節(jié)間血管及背動(dòng)脈生長(zhǎng)情況;3.構(gòu)建miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒，GCP觀察法確定腺病毒轉(zhuǎn)染最佳MOI值，腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC48小時(shí)后，提取HASMC總RNA，qRT-PCR檢測(cè)miR-22表達(dá)變化;miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC，于轉(zhuǎn)染后0h、

3、12h、24h、36h、48h用CCK-8法檢測(cè)HASMC增殖變化，轉(zhuǎn)染后36h顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)HASMC增殖;miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC48小時(shí)后利用annexinⅤ-APC及7-AAD雙染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)HASMC凋亡;利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-22靶基因;分別提取正常捐獻(xiàn)者與主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈組織總蛋白，miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC72小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)m

4、iR-22預(yù)測(cè)MAPK14表達(dá)變化;siRNA沉默MAPK14的表達(dá)，MAPK14 siRNA與Anti-miR-22共同轉(zhuǎn)染HASMC，annexinⅤ-APC及7-AAD雙染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)HASMC凋亡，與對(duì)照組比較MAPK14和Anti-miR-22對(duì)HASMC凋亡的作用;4.3周齡FVB小鼠普通飲食喂養(yǎng)，飲用水中添加β-氨基丙腈1 g/kg/day，2周后，尾靜脈注射miR-22 Agomir/antagomir15OD/只

5、，持續(xù)喂養(yǎng)至小鼠7周齡時(shí)，局麻下小鼠背部皮下植入血管緊張素Ⅱ微泵（1μg/kg/min）24小時(shí)，小鼠注射大劑量苯巴比妥麻醉后處死，解剖分離主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈小鼠主動(dòng)脈，大體標(biāo)本觀察統(tǒng)計(jì)小鼠主動(dòng)脈夾層發(fā)生率，主動(dòng)脈分為3段，10％福爾馬林固定石蠟包埋切片，分別提取RNA、蛋白;通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-22表達(dá)含量;Western blot檢測(cè)MAPK14表達(dá)變化;小鼠主動(dòng)脈石蠟切片HE染色測(cè)量小鼠主動(dòng)脈中膜厚度(MT)、管腔直徑

6、(LD)，計(jì)算MT/LD; EVG染色比較小鼠主動(dòng)脈彈力纖維變化，Masson染色檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈膠原纖維變化。
　　結(jié)果:1.qRT-PCR驗(yàn)證了miR-22在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈組織中含量表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，通過(guò)熒光原位雜交及主動(dòng)脈細(xì)胞共定位，發(fā)現(xiàn)miR-22在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào);2.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因Tg(Flik1:egfp)斑馬魚(yú)系胚胎單細(xì)胞時(shí)期顯微注射MO-22，發(fā)現(xiàn)MO-22可使斑馬魚(yú)20-3

7、0phf時(shí)間內(nèi)miR-22表達(dá)下調(diào)(P＜0.05);miR-22下調(diào)可顯著抑制斑馬魚(yú)24phf節(jié)間血管的生長(zhǎng)，在斑馬魚(yú)30phf時(shí)MO-22可顯著抑制斑馬魚(yú)背動(dòng)脈的生長(zhǎng);3.Ad-miR-22和Anti-miR-22轉(zhuǎn)染HASMC的最佳MOI值為100; Anti-miR-22轉(zhuǎn)染HASMC36h后可抑制HASMC的增殖，Ad-miR-22在轉(zhuǎn)染HASMC36h時(shí)可促進(jìn)HASMC的增殖;Anti-miR-22較其對(duì)照組相比促進(jìn)HASMC

8、的凋亡，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MAPK14是miR-22的潛在靶基因，通過(guò)提取人主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈組織和HASMC蛋白進(jìn)行Western blot證明MAPK14符合miR-22的靶基因生物學(xué)功能，與miR-22在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈組織中的表達(dá)相反，MAPK14在主動(dòng)脈夾層患者組織中表達(dá)上調(diào)，且在HASMC中，Ad-miR-22可使MAPK14表達(dá)下調(diào)，Anti-miR-22則促進(jìn)MAPK14的表達(dá);通

9、過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)直接證實(shí)MAPK14是miR-22的靶基因;利用siRNA沉默HASMCMAPK14的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)腺病毒抑制HASMC中miR-22的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HASMC的凋亡受到顯著抑制;4.通過(guò)qRT-PCR證明Ago-miR-22可顯著促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈miR-22的表達(dá)，Antago-miR-22較對(duì)照組相比抑制小鼠主動(dòng)脈miR-22的表達(dá)(P＜0.05);收集小鼠主動(dòng)脈提取組織總蛋白，Western blot證明Ago-

10、miR-22組小鼠主動(dòng)脈MAPK14表達(dá)上調(diào)，而Antago-miR-22組小鼠主動(dòng)脈組織MAPK14表達(dá)下調(diào)。通過(guò)對(duì)小鼠主動(dòng)脈解剖進(jìn)行大體標(biāo)本觀察統(tǒng)計(jì)，夾層造模組、agomir-22組、agomir-NC組5/18(27.8％)，antagomir-22組、antagomir-NC組小鼠主動(dòng)脈夾層發(fā)生率分別為6/18(33.3％)、12/18(66.7％)、11/17(64.7％)、7/18(38.9％)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，agomir-2

11、2組較其對(duì)照組相比可顯著抑制小鼠主動(dòng)脈夾層的發(fā)生(P＜0.05)，antagomir-22組較其對(duì)照組相比主動(dòng)脈夾層發(fā)生無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.1267);夾層造模組、agomir-22組、agomir-NC組、antagomir-22組、antagomir-NC組五組的中膜厚度值分別是74.76±4.59μ m、118.94±5.76μ m、81.23±3.05μ m、65.59±3.74μ m、94.76±4.02μ m;主動(dòng)脈管腔直

12、徑分別是2.54±0.21mm、1.55±0.11mm、3.12±0.2mm、3.74±0.2mm、1.55±0.11mm、2.94±0.14mm;miR-22上調(diào)可使小鼠主動(dòng)脈MT增大，LD降低，MT/LD增大，而miR-22下調(diào)使小鼠主動(dòng)脈MT降低，LD增大，MT/LD降低;agomir-22組較對(duì)照相比增加小鼠主動(dòng)脈彈力纖維，antagomir-22組較對(duì)照組相比使小鼠主動(dòng)脈彈力纖維減少，結(jié)構(gòu)紊亂，甚至斷裂; miR-22上調(diào)可增

13、加小鼠主動(dòng)脈膠原纖維，而miR-22下調(diào)導(dǎo)致小鼠主動(dòng)脈中外膜膠原纖維降低。
　　結(jié)論:1.miR-22在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào);2.MO-22可顯著抑制斑馬魚(yú)24phf節(jié)間血管生長(zhǎng)并抑制30phf斑馬魚(yú)背動(dòng)脈生長(zhǎng);3.Anti-miR-22抑制HASMC增殖，Ad-miR-22可促進(jìn)HASMC增殖，Anti-miR-22通過(guò)上調(diào)miR-22靶基因MAPK14的表達(dá)促進(jìn)HASMC凋亡;4.MAPK14在小鼠主動(dòng)