EV71病毒抗原蛋白VP1基因重組載體疫苗研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)是導(dǎo)致手足口病的主要病原體之一,常引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的嚴(yán)重疾病。Vp1是EV71病毒主要的抗原基因,其編碼的外衣殼蛋白在感染宿主細(xì)胞時起重要作用。因此,我們選擇vp1作為研制EV71疫苗的目標(biāo)基因。LTB有很強(qiáng)的免疫原性和佐劑活性且無毒。本研究中選用LTB作為分子內(nèi)粘膜免疫佐劑。
　　 雙歧桿菌正常存在于人類腸道內(nèi),是一種重要的有益的生菌,對人體腸道微環(huán)境有重要的調(diào)節(jié)功能,對嬰幼兒腸道有獨(dú)特的保護(hù)作

2、用。雙歧桿菌是人類腸道的自然宿主且可以粘附于腸道上皮細(xì)胞。因此,本研究的目的是將雙歧桿菌發(fā)展成一個表達(dá)EV71 VP1蛋白和ETECLTB蛋白的雙價口服活疫苗的抗原表達(dá)系統(tǒng)。
　　 目的：
　　 構(gòu)建攜帶EV71病毒vp1基因和ltb基因的融合表達(dá)載體并在大腸桿菌和雙歧桿菌中進(jìn)行表達(dá),鑒定其抗原性和免疫原性。為制備預(yù)防EV71感染的口服疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 用重疊延伸PCR(overlap e

3、xtension PCR)法獲得人腸道病毒71型vp1片段與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(ltb)的融合基因。設(shè)計14對引物通過重疊延伸PCR技術(shù)合成vp1基因,以ETEC(44815)質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴(kuò)增ltb基因,將vp1基因與ltb基因連接并測序,連接產(chǎn)物插入原核表達(dá)質(zhì)粒pBEX,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBEX-VP1-LTB,轉(zhuǎn)化E.coli B1221(DE3)進(jìn)行表達(dá),SDS-PAGE及Western blotting分析其表

4、達(dá)。將表達(dá)VP1-LTB的大腸桿菌超聲破碎后離心提取包涵體制備抗原,經(jīng)口灌喂免疫小鼠,檢測小鼠血清中抗VP1的IgG、IgA,糞便sIgA和腸粘液sIgA,鑒定其免疫原性。電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pBEX-VP1-LTB轉(zhuǎn)入雙歧桿菌,Western-blot分析其抗原性。口服免疫SD大鼠,采集血清和糞便樣品,ELISA檢測機(jī)體特異的血清IgG和腸道IgA抗體。
　　 結(jié)果
　　 合成的Vp1基因全長891bp,測序結(jié)果與預(yù)期相

5、符,重組表達(dá)質(zhì)粒pBEX-VP1-LTB經(jīng)PCR及雙酶切鑒定,表明構(gòu)建正確;目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中獲得了表達(dá),Western-blot分析結(jié)果表明該蛋白具有與EV71 VP1抗體結(jié)合的抗原性,免疫后小鼠血清抗VP1的IgG、IgA以及糞便sIgA和腸粘液sIgA明顯高于PBS和GST對照組。電轉(zhuǎn)法成功將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雙歧桿菌,Western-blot分析結(jié)果表明該蛋白具有與EV71病毒抗體結(jié)合的抗原性。ELISA檢測

6、表明重組雙歧桿菌免疫后的SD大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特性的IgG和IgA抗體。
　　 結(jié)論
　　 應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)成功構(gòu)建了EV71 VP1-LTB融合表達(dá)質(zhì)粒,并在E.coli BL21(DE3)和雙歧桿菌中獲得有生物學(xué)功能的VP1表達(dá)產(chǎn)物,該蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,為研制EV71分子內(nèi)佐劑疫苗打下了基礎(chǔ)。該研究表明重組載體pBEX-VP1-LTB可以在雙歧桿菌中表達(dá)。該重組VP1-LTB基因工程雙歧桿菌可誘發(fā)SD