腸道病毒EV71基因檢測技術的初步研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)為小RNA病毒科腸道病毒屬成員,是目前腸道病毒群中最晚發(fā)現(xiàn)的病毒,其感染性強且致病率高,是引起手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原體。由于腸道病毒EV71對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性,其并發(fā)癥包括無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、脊髓灰質炎樣麻痹(poliomyelitis-like paralysis)、急性無力肢體麻痹

2、(acute flaccidparalysis)、神經(jīng)源性肺水腫(neulrogena pulmonary edema,NPE)等,重癥患者比例、致殘率及致死率均明顯高于其他腸道病毒。而感染腸道病毒EV71患者,多為無臨床癥狀或出現(xiàn)輕微類似感冒的癥狀,常被患者忽視而轉成重癥患者,其危害性不容小覷。腸道病毒EV71感染疾病是全球性傳染病,在世界范圍內(nèi)已引起10余次大規(guī)模的暴發(fā)與流行。目前對其重癥感染尚無有效的預防疫苗及治療手段,研究相關早

3、期診斷的試劑對于手足口病的防治具有重要的臨床意義。
　　 目前常用的實驗室診斷方法包括免疫學方法、病毒分離培養(yǎng)、PCR方法等,但都分別存在難以早期診斷、敏感度低的缺陷。由于人體對于外來病原體的免疫產(chǎn)生有一定的滯后,使得免疫學的檢測方法不能在患者患病早期得出相應的結果,敏感性相對較低,延誤病情。病毒分離的方法雖然準確,其方法復雜,操作繁瑣,容易延誤最佳時機。PCR方法雖不存在這個問題,但易出現(xiàn)假陽性結果。因此,都不能實現(xiàn)有效確診的

4、早期診斷。基因芯片與熒光定量PCR技術的方法,在核酸的水平上進行檢測,對人體內(nèi)所具有的相應核酸可達到早期檢測的目的,為腸道病毒EV71的早期診斷,提供了快速、高效、敏感、自動化的方法。
　　 本課題首先構建了腸道病毒EV71的cDNA亞克隆,為進一步后續(xù)建立腸道病毒EV71早期檢測方法提供實驗基礎。其次,建立了熒光定量PCR檢測方法,并對其特異性、重復性和靈敏性進行了分析驗證。再次,篩選設計出腸道病毒EV71的檢測探針,以構建的

5、亞克隆作為標準品,構建腸道病毒71型寡核苷酸芯片,為今后多病毒的聯(lián)合檢測芯片的制備打下基礎。
　　 本課題第一部分對腸道病毒EV71中的VP4、VP2、VP3、VP1基因進行了長片段的RT-PCR擴增,構建了cDNA亞克隆。由于腸道病毒EV71屬于RNA病毒,從臨床樣品中獲取的腸道病毒EV71基因組的量非常少,因此在逆轉錄過程中,對其進行了優(yōu)化。第一,使用二步法的反轉錄流程,將引物和RNA在65℃變性15min,消除可能存在的聚

6、合物和二聚體；37℃逆轉錄1h,溫度升高到85℃10min,消除RNA-cDNA雜交體。第二,針對RNA模板存在的二級結構及PolyA尾結構,在逆轉錄過程中,只加入隨機引物進行延伸,隨機引物適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆轉錄反應。雖然該過程使特異性會略微下降,但效果較為穩(wěn)定,得到cDNA產(chǎn)物較多。成功構建的亞克隆區(qū)間包括腸道病毒EV71序列的577bp-3581bp。包括病毒的結構蛋白 VP4序列、結構蛋白VP3序列

7、、結構蛋白VP2序列、結構蛋白VP1序列。該亞克隆的構建,不僅為后續(xù)臨床檢測方法的建立,提供了有效的陽性質粒；也為研究腸道病毒分型、感染、復制及基因工程疫苗的研制提供材料。
　　 熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。檢測根據(jù)所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。SYBR—Green染料法是熒光染料方法的典型代表。SYBR-Gr

8、een是一種雙鏈DNA集合染料,能與DNA雙鏈的小溝特異性結合,PCR反應中高溫變性時,DNA雙鏈分開,無熒光,而PCR反應中低溫復性和延伸時,形成雙鏈DNA,SYBR-Green發(fā)熒光,此階段采集信號。由于PCR擴增產(chǎn)物越多,與SYBR-Green結合越多,熒光信號也就越強。通過釋放出的熒光值來進行檢測,可以對任何目的基因定量,此方法不需要合成高價的探針,而只需要通過設計并合成特異性強的引物,增強其特異性,達到檢測的目的。
　　

9、 本課題第二部分建立了SYBR-Green熒光定量PCR方法,檢測由腸道病毒EV71引發(fā)的手足口病。針對其保守區(qū)域VP1基因,通過軟件ABI primerExpress2.0軟件設計引物,目的片段為88bp,用第一部分所構建的亞克隆質粒,作為陽性模板建立SYBR-Green熒光定量PCR標準曲線及陽性對照,并做重復性試驗,及方法特異性的實驗評價。成功構建的SYBR-Green熒光定量PCR標準曲線:Y=-3.01x+36.95,R2為

10、0.994,平均試驗間變異系數(shù)0.945％。分別用30例手足口病的糞便樣本及30例正常人糞便樣本對此方法進行驗證,并與逆轉錄PCR檢測結果相比較。
　　 寡核苷酸基因檢測芯片具有高度的特異性和靈敏性,由于寡核苷酸芯片固定的探針為特定的DNA寡核苷酸片段,眾多基因在同一張芯片上雜交,雜交條件統(tǒng)一,并經(jīng)過優(yōu)化,可防止擴增失敗對實驗的影響。選擇60mer長度的寡核苷酸探針,可取得特異性及敏感度的平衡?；谝陨咸攸c,本研究運用寡核苷酸基

11、因檢測芯片進行檢測。
　　 本課題的第三部分,以近年來在中國地區(qū)爆發(fā)較多的腸道病毒EV71的C4亞型基因組(登錄號:FJ360544)作為研究對象。經(jīng)分析整個基因組有一個開放閱讀框,編碼含2194個氨基酸的多聚蛋白,其兩側為5’端和3’端的非編碼區(qū)域。腸道病毒EV71編碼4個結構蛋白和7個非結構蛋白。將腸道病毒EV71的基因組全長序列,分別與序列相似的的脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒進行BLAST比對,根據(jù)比對結果剔除同源

12、性高的區(qū)域,使用軟件Allele ID6.0對同源性<40分的區(qū)段進行二次或者三次比對,分析得到結構蛋白VP4(VP4基因)、結構蛋白VP2(VP2基因)、結構蛋白 VP3(VP3基因)、結構蛋白 VP1(VP1基因)作為設計寡核苷酸探針的備選序列。運用生物學軟件Array Designer4.2對特異性的序列進行分析,設計出長度均一,各種長度合適的探針20條。陽性對照是標記中通用引物的重復序列,陰性對照是與腸道病毒EV71沒有同源性的

13、水稻基因序列,并包括空白對照。以第一部分中 VP4、VP2、VP3、VP1基因的亞克隆,作為陽性質粒,對寡核苷酸探針進行篩選；同時對也能引起手足口病的柯薩奇A組病毒16型質粒進行RD熒光標記雜交,檢測探針的特異性。根據(jù)熒光信號值、信噪比,最終篩選出符合要求的高特異性和高靈敏度的寡核苷酸探針14條,即:1、2(針對VP4基因)；4、6、7(針對VP2基因)；9、10、12(針對VP3基因)；13、14、16、17、19、20(針對VP1基

14、因)。腸道病毒EV71寡核苷酸的制備,為進一步建立多腸道病毒的聯(lián)合檢測芯片打下實驗基礎。
　　 綜上所述,本研究通過NCBI進行比對分析,建立了腸道病毒EV71的cDNA亞克隆,其中包括保守區(qū)域VP4基因、VP2基因、VP3基因和VP1基因。根據(jù)國際上分型的基因VP1,建立了SYBR-Green熒光定量PCR方法,進一步對腸道病毒EV71進行定量分析。并根據(jù)生物學軟件對保守區(qū)域設計寡核苷酸檢測芯片,經(jīng)過實驗操作,對其進行優(yōu)化,篩