異丙酚對(duì)發(fā)育期小鼠大腦海馬齒回及周邊皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的影響.pdf

1、背景與目的:
　　我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，每年都有許多的兒童接受全麻手術(shù)和治療。麻醉藥物是否會(huì)對(duì)發(fā)育期兒童的智力產(chǎn)生影響？會(huì)不會(huì)導(dǎo)致以后的學(xué)習(xí)功能障礙？這一直是眾多家長(zhǎng)關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題，也是麻醉這一領(lǐng)域一直爭(zhēng)議激烈的問(wèn)題。認(rèn)知與學(xué)習(xí)是人類非常復(fù)雜的能力，受多種因素的影響;麻醉藥物多種多樣，發(fā)揮作用的機(jī)制也各不相同。因此到目前為止，雖然有一些臨床試驗(yàn)認(rèn)為:麻醉藥物對(duì)兒童的認(rèn)知功能存在影響，但其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性仍然受到很大的質(zhì)疑。近幾年，相關(guān)的

2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):暴露于臨床常用的麻醉藥物可以導(dǎo)致發(fā)育期動(dòng)物大腦神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育異常從而引起遠(yuǎn)期的認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)能力的下降。
　　在我國(guó)目前臨床上最常用于小兒的全麻藥物是異丙酚。異丙酚由于誘導(dǎo)快速，作用時(shí)間短，恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)備受麻醉醫(yī)生的喜愛(ài)，常用于小兒短小手術(shù)的麻醉及有創(chuàng)檢查。以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)認(rèn)為:麻醉藥物是通過(guò)抑制N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體(NMDA)或者激活γ-氨基丁酸受體(GABA)產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用。異丙酚也是GABA受體的

3、激動(dòng)劑，是否會(huì)有相應(yīng)的神經(jīng)毒性，目前國(guó)際上研究較少。臨床上關(guān)于異丙酚導(dǎo)致遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)障礙的研究因其產(chǎn)生機(jī)制不明，也備受爭(zhēng)議。
　　眾所周知，大腦是人類的重要功能器官，是脊髓動(dòng)物高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，是控制運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生感覺(jué)實(shí)現(xiàn)高級(jí)功能的神經(jīng)中樞。其中，海馬被認(rèn)為與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)也是神經(jīng)細(xì)胞增殖的重要區(qū)域。而皮質(zhì)主要由錐體細(xì)胞構(gòu)成，由豐富的錐體細(xì)胞構(gòu)成的各種神經(jīng)環(huán)路來(lái)實(shí)現(xiàn)信息的傳導(dǎo)功能。發(fā)育期海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞的分化異常以及皮質(zhì)區(qū)成

4、熟錐體細(xì)胞的減少和樹(shù)突發(fā)育的異常，有可能對(duì)遠(yuǎn)期的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生重要影響。因此，我們研究異丙酚對(duì)發(fā)育期小鼠大腦海馬神經(jīng)干細(xì)胞及皮質(zhì)錐體神經(jīng)細(xì)胞的影響，尋求調(diào)控大腦認(rèn)知學(xué)習(xí)功能的機(jī)制。
　　近年的研究表明，全麻藥物引起的認(rèn)知功能障礙與暴露于麻醉藥物的時(shí)期、時(shí)間長(zhǎng)短、劑量等有相關(guān)性。出生后2周暴露于麻醉藥物就可以引起相關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。P7是嚙齒類動(dòng)物大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的高峰時(shí)期，這一時(shí)期暴露與麻醉藥物也出現(xiàn)相應(yīng)的凋亡高峰。

5、最近的研究發(fā)現(xiàn):異丙酚可以影響成年動(dòng)物大腦海馬區(qū)新生神經(jīng)元的存活，干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞的成熟;它可以顯著地減少三月齡小鼠大腦海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞。這一改變可能進(jìn)而影響到成熟的神經(jīng)元整合進(jìn)入神經(jīng)環(huán)路的過(guò)程，導(dǎo)致了信息在神經(jīng)細(xì)胞間的傳遞障礙。有研究表明:破壞海馬體及周圍的皮質(zhì)部分會(huì)造成失憶。對(duì)于發(fā)育期的動(dòng)物，異丙酚是否也通過(guò)干預(yù)海馬和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化，導(dǎo)致臨時(shí)的信息傳導(dǎo)障礙以及神經(jīng)環(huán)路的形成而引起遠(yuǎn)期

6、的學(xué)習(xí)功能障礙？
　　方法:
　　研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇:C57小鼠P7，連續(xù)3天，每天1次腹腔注射Prop30mg/kg、Prop60mg/kg、同體積脂肪乳劑構(gòu)建模型。免疫組化檢測(cè):海馬區(qū):DCX與Brdu雙標(biāo)觀察異丙酚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖以及增殖的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟神經(jīng)元的情況、NeuN染色觀察海馬區(qū)成熟神經(jīng)元數(shù)量的變化、高爾基染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)變化。皮質(zhì)區(qū):MAP2B蛋白標(biāo)記觀察皮質(zhì)錐體細(xì)胞的樹(shù)突棘密度、高爾基染色

7、觀察皮質(zhì)錐體細(xì)胞樹(shù)突棘形態(tài)、NeuN觀察皮質(zhì)區(qū)成熟神經(jīng)元數(shù)量、GFAP觀察皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量變化。
　　結(jié)果:
　　1.運(yùn)用標(biāo)記細(xì)胞增殖的特異性抗原標(biāo)記物Brdu與標(biāo)記成熟神經(jīng)元的DCX觀察異丙酚注射后對(duì)海馬齒回新增神經(jīng)干細(xì)胞增值的影響及增值的神經(jīng)干細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元的情況。熒光雙標(biāo)顯示:與對(duì)照組比較，30mg組Brdu數(shù)量減少無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，60mg組Brdu數(shù)量顯著減少;30mg組Brdu+DCX數(shù)量減少無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義，60mg組Brdu+DCX數(shù)量顯著減少。藥物的劑量組間統(tǒng)計(jì)比較存在差異，以60mg組差異最為顯著。
　　2.運(yùn)用成熟神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN觀察不同劑量異丙酚注射后海馬齒回成熟神經(jīng)元數(shù)量。熒光標(biāo)記顯示:相同部位海馬齒回同等面積下的NeuN數(shù)量30mg組與對(duì)照組相比減少不明顯;60mg組與對(duì)照組相比細(xì)胞數(shù)量有減少但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.運(yùn)用高爾基染色顯示海馬齒回顆粒神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài):在蔡司顯微鏡X100光鏡下統(tǒng)計(jì)相同長(zhǎng)度的顆

9、粒細(xì)胞樹(shù)突棘總數(shù)，30mg組與對(duì)照組相比樹(shù)突棘總數(shù)有顯著減少;60mg組與對(duì)照組相比樹(shù)突棘總數(shù)顯著減少。成熟蘑菇狀棘突30mg組與60mg組同對(duì)照組相比顯著減少;瘦長(zhǎng)形棘突30mg組與60mg組同對(duì)照組比較明顯增多;丁圖狀棘突對(duì)照組，30mg組，60mg組3組比較無(wú)顯著差異。
　　4.采用免疫熒光GFAP標(biāo)記大腦皮質(zhì)中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量:30mg組與對(duì)照組相比單位面積上GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異;60mg組與對(duì)照組相比

10、單位面積上GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異。
　　5.免疫熒光NeuN標(biāo)記大腦皮質(zhì)中成熟神經(jīng)元數(shù)量:30mg組與對(duì)照組相比單位面積上NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量無(wú)顯著差異;60mg組與對(duì)照組相比單位面積上NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量無(wú)顯著差異。
　　6.MAP2B微觀相關(guān)蛋白標(biāo)記大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞樹(shù)突。采用光密度分析統(tǒng)計(jì)MAP2B的組間表達(dá)差異:與對(duì)照組相比，30mg組光密度分析MAP2B表達(dá)無(wú)顯著差異;60mg組光密度分析M

11、AP2B表達(dá)明顯下降。
　　7.高爾基染色顯示小鼠大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞樹(shù)突棘形態(tài):30mg組與對(duì)照組相比樹(shù)突棘總數(shù)減少無(wú)顯著差異，成熟蘑菇樣形態(tài)的樹(shù)突棘與對(duì)照組相比有顯著減少;60mg組與對(duì)照組相比，樹(shù)突棘總數(shù)有顯著減少，成熟蘑菇樣形態(tài)的樹(shù)突棘也顯著減少。
　　結(jié)論:
　　1.異丙酚抑制發(fā)育期小鼠海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞的分化與用藥劑量有相關(guān)性。
　　2.異丙酚抑制成熟神經(jīng)元的分化數(shù)量，增加其凋亡與劑量呈相關(guān)性。