鏈霉菌微型轉座系統(tǒng)的構建及初步應用.pdf

1、隨著天藍色鏈霉菌A3（2）和阿維鏈霉菌MA-4680的全基因組序列的發(fā)表，鏈霉菌的基礎研究已進入后基因組時代，大量新基因和功能未知基因的功能有待鑒定。大規(guī)模突變體庫的構建是功能基因組研究的一個重要內(nèi)容，而利用轉座子進行插入突變構建突變體庫則是目前廣泛應用的方法之一。 轉座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在鏈霉菌中應用的大多數(shù)轉座子卻普遍存在轉座效率低下或操作繁瑣等缺點。僅有Tn4556及其衍生物和Tn5衍生轉座子能夠被應用

2、于突變體庫的構建和突變菌株的篩選。但是它們依然存在各種缺陷。 針對現(xiàn)有轉座子系統(tǒng)的一些缺陷，構建了應用于鏈霉菌中的攜帶微型轉座子mini-Tn4560A的質(zhì)粒載體pHL265。它攜帶的轉座酶基因tnpA位于轉座子mini-Tn4560A外部，轉座發(fā)生后，質(zhì)粒載體pHL265由于不具有鏈霉菌復制子而不能在宿主菌中存在，失去了轉座酶基因的微型轉座子理論上將不可能發(fā)生二次轉座；帶有大腸桿菌與鏈霉菌進行屬間接合轉移的起始位點oriT，將

3、有利于轉座子載體通過接合轉移的方式從大腸桿菌導入到鏈霉菌中，大大降低了原生質(zhì)體轉化過程中自體突變的可能；轉座子直接進行體內(nèi)轉座，省去用Tn5體外轉座時要構建基因組文庫，再將體外轉座突變體庫重轉入鏈霉菌，篩選突變菌株的復雜過程。 利用該轉座子系統(tǒng)轉座篩選得到天藍色鏈霉菌M145的約1000株轉座突變株。其中不乏表型異常的菌株。選取其中的8株，經(jīng)Southern雜交驗證可知該轉座子的轉座基本具有隨機性；通過連續(xù)的松弛傳代培養(yǎng)可知該轉