metK對那西肽生物合成的影響和鏈霉菌高效轉座系統(tǒng)的構建.pdf

1、第一部分
　　 世界上三分之二的抗生素由鏈霉菌產生，因而鏈霉菌在大規(guī)模工業(yè)生產和化學合成酶方面有特殊作用。鏈霉菌基因工程的研究近年來是一個活躍的領域。本論文研究著眼于那西肽，這是一種含有多個噻唑環(huán)并富含硫元素的非核糖體肽類抗生素，由活躍鏈霉菌Streptomyces.actuosus產生。本研究在鏈霉菌育種方法的基礎上，主要利用基因工程和培養(yǎng)基組分優(yōu)化的方法來研究那西肽生物合成的代謝途徑以進一步提高那西肽的產量，適于工業(yè)生產的需

2、要。
　　 首先，構建含有來源于釀酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，通過原生質體轉化將其克隆至S.actuosus，構建成基因工程菌Z-SAM，并用高效液相(HPLC)證明了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在該株菌中的含量比出發(fā)菌株Z-10提高了9倍，達到9.5μg/ml。
　　 其次，為探索那西肽的生物合成代謝途徑，本研究對S.actuosus發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化，有針對性的提高培養(yǎng)基

3、中的碳源和氮源，采用2％麥芽糖，2％葡萄糖，4％淀粉，4％黃豆粉，0.25％硫酸銨，0.2％硫酸鈉，0.04％K2HPO4，0.01％MnSO4，0.05％MgSO4，0.25％NaCl，0.003％FeSO4，0.005％ZnSO4作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別在72，120和168小時時補加2％黃豆粉，0.01％絲氨酸，1.25％麥芽糖，1.25％葡萄糖，0.15％硫酸鈉和0.15％硫酸銨。在發(fā)酵終止后發(fā)現(xiàn)基因工程菌Z-SAM的那西肽產量較

4、出發(fā)菌株提高了80％，菌株生產穩(wěn)定，發(fā)酵單位達到1746μg/ml。
　　 最后，本論文發(fā)現(xiàn)Z-SAM菌體中半胱氨酸的含量比出發(fā)菌株Z-10提高了一倍，根據實驗結果和文獻報道的SAM逆轉硫途徑，本研究推測在S.actuosus中存在另一條由SAM主導的逆轉硫合成那西肽的途徑。即由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)的高表達導致SAM大量產生，SAM激活了該合成途徑，并在其中起到硫提供者的角色，在通過了一系列代謝后使得菌體內半胱氨

5、酸含量提高。而半胱氨酸是那西肽生物合成的重要前體，所以進而使得那西肽的產量提高。
　　 第二部分
　　 隨著天藍色鏈霉菌A3(2)的全基因組序列的發(fā)表，鏈霉菌的基礎研究已進入后基因組時代，大量新基因和功能未知基因的功能有待鑒定。對這類基因的研究將會為闡明初生代謝和次生代謝的基因調控等生物學問題以及次生代謝藥物的合成機制提供更多的實驗證據。因此大規(guī)模突變體庫的構建是功能基因組研究的一個重要內容，而利用轉座子進行插入突變構建

6、突變體庫則是目前廣泛應用的方法之一。
　　 轉座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在鏈霉菌中應用的大多數轉座子卻普遍存在轉座效率低下或操作繁瑣等缺點。本研究利用天然存在于諾卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana)YP21中的轉座子IS204，成功構建了一個鏈霉菌中的微型轉座質粒pDZY101。該質粒帶有大腸桿菌與鏈霉菌進行屬間接合轉移的起始位點oriT，可通過簡單的接合轉移將其從大腸桿菌導入到鏈霉菌中。

7、實驗證明該轉座系統(tǒng)克服了鏈霉菌中現(xiàn)有轉座子系統(tǒng)的一些缺陷，操作簡便且具有高效、隨機、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點。此外本論文在pDZY101的基礎構建了一系列衍生質粒對轉座酶的作用機制進行了初步研究，證明了IS204的轉座酶在鏈霉菌中只能識別帶有一對緊挨著的反向重復序列的環(huán)狀片斷，并進而推測IS204的轉座過程涉及到一個環(huán)狀中間體。通過對轉座突變株的大量測序和Southern雜交實驗證實該轉座系統(tǒng)隨機性非常好，而且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。這些特點使得該