傳代和低氧培養(yǎng)對山羊顳下頜關節(jié)盤細胞表型及細胞骨架的影響.pdf

1、目的：
　　探討傳代和低氧培養(yǎng)對山羊顳下頜關節(jié)盤細胞表型和細胞骨架的影響，為關節(jié)盤組織工程自組裝技術種子細胞的選擇提供依據，為關節(jié)盤細胞培養(yǎng)選擇適宜的氧環(huán)境。
　　方法：
　　體外分離、培養(yǎng)山羊顳下頜關節(jié)盤細胞，傳代至第三代（P3），收集原代（P0）至第三代細胞（P3）。P3代細胞分別于不同低氧水平（2％O2，4%O2，8%O2）下培養(yǎng)，每次均以常氧（21%O2）培養(yǎng)作為對照。通過細胞形態(tài)學、糖胺多糖和膠原蛋白染色觀察

2、，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學和實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）進行細胞表型鑒定。通過細胞骨架蛋白免疫熒光染色和RT-qPCR檢測關節(jié)盤細胞骨架蛋白肌動蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）和波形蛋白（Vimentin）表達情況；MTT實驗及流式細胞術檢測不同氧濃度下關節(jié)盤細胞生長、增殖情況。
　　結果：
　　1、傳代培養(yǎng)過程中，關節(jié)盤細胞表型發(fā)生改變，表現(xiàn)為圓形細胞減少，長梭形細胞增多，糖胺多糖表達減少；

3、I、II型膠原蛋白表達在P2代明顯增強，P3代明顯減弱；Aggrecan mRNA表達在P2和P3代明顯減弱（P<0.01），COL I和COL II mRNA表達在P2代明顯增強，P3代減弱（P<0.01），COL I/COL II的比值在P1代最高（P<0.01）。關節(jié)盤細胞骨架的變化表現(xiàn)為Actin表達增加，Tubulin和Vimentin表達在P2代最高，基因表達分析結果與熒光強度分析顯示一致。
　　2、MTT結果顯示，與

4、21%O2組比較，4%O2和8%O2條件下，細胞增殖明顯，在2%O2條件下，細胞生長緩慢(P<0.05)。細胞周期分析結果顯示，與21%O2組比較，2%O2、4%O2和8%O2條件下，G0/G1期細胞減少，S期或G2/M期細胞增多(P<0.05)，細胞表現(xiàn)出較好的活力。細胞凋亡結果顯示，各低氧組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率與對照組（21%O2）相比無明顯差異（P>0.05）。
　　3、低氧培養(yǎng)時，4%O2和8%O2條件下，細胞突起伸

5、長，以長梭形細胞為主，I、II型膠原蛋白表達明顯增強；2%O2條件下，少量細胞變圓，I型膠原弱表達。糖胺多糖表達在各氧氣濃度下未見明顯變化。2%O2條件下，COL I和Actin mRNA表達下調，Tubulin表達顯著增強；4%O2條件下，三種細胞骨架蛋白表達明顯減弱（P<0.05）。8%O2條件下，關節(jié)盤細胞表型相關基因顯著下調（P<0.01）。
　　結論：
　　1、綜合考慮細胞表型和細胞骨架的改變可以更好的指導組織工程