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文檔簡介
1、目的:
探討傳代和低氧培養(yǎng)對山羊顳下頜關節(jié)盤細胞表型和細胞骨架的影響,為關節(jié)盤組織工程自組裝技術種子細胞的選擇提供依據,為關節(jié)盤細胞培養(yǎng)選擇適宜的氧環(huán)境。
方法:
體外分離、培養(yǎng)山羊顳下頜關節(jié)盤細胞,傳代至第三代(P3),收集原代(P0)至第三代細胞(P3)。P3代細胞分別于不同低氧水平(2%O2,4%O2,8%O2)下培養(yǎng),每次均以常氧(21%O2)培養(yǎng)作為對照。通過細胞形態(tài)學、糖胺多糖和膠原蛋白染色觀察
2、,Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學和實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)進行細胞表型鑒定。通過細胞骨架蛋白免疫熒光染色和RT-qPCR檢測關節(jié)盤細胞骨架蛋白肌動蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)和波形蛋白(Vimentin)表達情況;MTT實驗及流式細胞術檢測不同氧濃度下關節(jié)盤細胞生長、增殖情況。
結果:
1、傳代培養(yǎng)過程中,關節(jié)盤細胞表型發(fā)生改變,表現(xiàn)為圓形細胞減少,長梭形細胞增多,糖胺多糖表達減少;
3、I、II型膠原蛋白表達在P2代明顯增強,P3代明顯減弱;Aggrecan mRNA表達在P2和P3代明顯減弱(P<0.01),COL I和COL II mRNA表達在P2代明顯增強,P3代減弱(P<0.01),COL I/COL II的比值在P1代最高(P<0.01)。關節(jié)盤細胞骨架的變化表現(xiàn)為Actin表達增加,Tubulin和Vimentin表達在P2代最高,基因表達分析結果與熒光強度分析顯示一致。
2、MTT結果顯示,與
4、21%O2組比較,4%O2和8%O2條件下,細胞增殖明顯,在2%O2條件下,細胞生長緩慢(P<0.05)。細胞周期分析結果顯示,與21%O2組比較,2%O2、4%O2和8%O2條件下,G0/G1期細胞減少,S期或G2/M期細胞增多(P<0.05),細胞表現(xiàn)出較好的活力。細胞凋亡結果顯示,各低氧組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率與對照組(21%O2)相比無明顯差異(P>0.05)。
3、低氧培養(yǎng)時,4%O2和8%O2條件下,細胞突起伸
5、長,以長梭形細胞為主,I、II型膠原蛋白表達明顯增強;2%O2條件下,少量細胞變圓,I型膠原弱表達。糖胺多糖表達在各氧氣濃度下未見明顯變化。2%O2條件下,COL I和Actin mRNA表達下調,Tubulin表達顯著增強;4%O2條件下,三種細胞骨架蛋白表達明顯減弱(P<0.05)。8%O2條件下,關節(jié)盤細胞表型相關基因顯著下調(P<0.01)。
結論:
1、綜合考慮細胞表型和細胞骨架的改變可以更好的指導組織工程
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