HOXD10在原發(fā)性肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其主要病理類型為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占所有原發(fā)性肝癌病例的90％以上。我國是PLC的高發(fā)地區(qū)，雖然目前手術(shù)仍是治療HCC的主要手段，但是由于大多數(shù)患者在確診時已屬晚期，失去了手術(shù)治療的機會，同時由于其侵襲力強，轉(zhuǎn)移快，術(shù)后復(fù)發(fā)率高等，使HCC的治療效果并不理想，預(yù)后差，生

2、存期短，死亡率高。因此，早期診斷及早期治療對改善HCC患者的預(yù)后十分重要，探索HCC的發(fā)病機制對于研發(fā)有效的治療策略具有極其重要的意義。
　　同源框基因（homeobox，HOX）在胚胎發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要作用，其所編譯的蛋白質(zhì)多為參與信號通路調(diào)控的關(guān)鍵分子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。HOXD10是HOX家族的基因之一，通過抑制調(diào)控細胞外基質(zhì)重塑以及細胞遷徙的相關(guān)基因使內(nèi)皮細胞維持于靜默高分化的狀態(tài)。HOXD10過表達或缺

3、失在惡性腫瘤中均可存在，在腫瘤的細胞增殖、存活、侵襲以及遷徙中發(fā)揮重要作用，而目前對于HOXD10在原發(fā)性HCC患者腫瘤組織中表達的研究鮮見系統(tǒng)報道。
　　第一部分：HOXD10基因及其相關(guān)上下游調(diào)控分子HOTAIR及miR-7在HCC患者腫瘤組織中的表達
　　目的：
　　檢測HOXD10、HOTAIR和miR-7在HCC患者腫瘤組織中的表達，探討HOXD10可能在HCC患者腫瘤組織中的作用。
　　方法：

4、　　收集山西省腫瘤醫(yī)院2013年1月至2015年12月HCC患者15例的新鮮腫瘤組織以及癌周3 cm處的組織標本，運用RT-PCR、蛋白印跡法及免疫組織化學檢測HOXD10 mRNA和蛋白，HOTAIR以及miR-7在腫瘤組織及癌周組織中的表達。
　　結(jié)果：
　?、賀T-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)相較于癌周組織，HCC腫瘤組織中HOXD10 mRNA和miR-7顯著降低，而HOTAIR表達顯著上升；
　?、诘鞍子≯E法檢測結(jié)果表明

5、HCC組織內(nèi)的HOXD10蛋白表達水平與癌周組織以及正常對照組織比較顯著降低；
　　③免疫組織化學結(jié)果提示，相較于癌周組織，HCC腫瘤組織內(nèi)的HOXD10蛋白的陽性反應(yīng)顆粒較少，提示HOXD10在HCC組織內(nèi)表達水平降低。
　　結(jié)論：
　　HOXD10作為一種抑癌因子，其表達異?？赡軈⑴c了HCC的發(fā)生，HOTAIR-HOXD10-miR-7通路異?？赡苁荋CC發(fā)生的潛在分子生物學調(diào)控機制。
　　第二部分：HOXD

6、10相關(guān)上、下游分子調(diào)控肝癌細胞的細胞生物學行為的機制研究
　　目的：
　　進一步探索HOXD10對HCC細胞生物學行為的影響，闡明HOXD10調(diào)控HCC細胞增殖、遷徙、侵襲以及凋亡的分子生物學機制。
　　方法：
　?、賹Σ煌伟┘毎辏℉uh-7，MHCC97-H，MHCC97-L，RBE，SK-HepG2，SMMC-7721，HCCLM3共7株）進行培養(yǎng)，qPCR檢測HOXD10 mRNA的基礎(chǔ)表達情況；篩選

7、合適的細胞株進行后續(xù)實驗。
　?、贖OXD10基因載體、HOTAIR siRNA以及miR-7 mimic的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染。取上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細胞株通過相關(guān)的分子生物學技術(shù)手段探索和驗證HOTAIR-HOXD10-miR-7這一通路在HCC發(fā)生中的作用。
　　③細胞增殖：采用CCK-8法檢測。
　　④細胞凋亡：采用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒以及流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。
　?、菁毎芷冢翰捎?/p>

8、流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
　?、藜毎忠u、遷移：采用Transwell細胞侵襲、遷移實驗。
　?、叩鞍子≯E法驗證調(diào)控HOXD10相關(guān)上、下游信號分子對細胞內(nèi)Bcl-2、P27，Cyclin D1、Caspase-8、RhoC、ROCK-1、MMP-2、MMP-9表達情況的影響。
　　結(jié)果：
　　①在7個細胞系中，HCCLM3（后縮寫為LM3）細胞系及HepG2細胞系中HOXD10 mRNA的表達水平最低，而

9、在RBE細胞系中表達最高，因此選擇HepG2以及LM3細胞系分別進行后續(xù)的分子生物學實驗和細胞學行為實驗。
　　②沉默HOTAIR可顯著增加HOXD10 mRNA和miR-7的水平，而過表達HOXD10可顯著增加miR-7的表達水平，miR-7參與調(diào)控與腫瘤遷徙和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP-2和MMP-9。
　?、圻^表達HOXD10可以顯著抑制LM3細胞的增殖。
　?、蹾OXD10過表達可誘導(dǎo)LM3細胞發(fā)生凋亡。
　　

10、⑤HOXD10過表達可誘導(dǎo)細胞處于G1期。
　　⑥HOXD10過表達可顯著降低HCCLM3的細胞遷徙能力。
　　⑦HOXD10過表達可顯著降低LM3細胞侵襲能力。
　?、噙^表達HOXD10或者沉默HOTAIR可顯著增加Caspase-8，P27的蛋白水平，降低Bcl-2，Cyclin D1的表達水平；過表達HOXD10可顯著降低ROCK及RHOC的蛋白水平；而過表達miR-7可顯著降低MMP-2和MMP-9的表達水平。

11、
　　結(jié)論：
　　調(diào)控HOTAIR-HOXD10-miR-7通路可以影響腫瘤生長、遷徙、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，過表達HOXD10能降低LM3細胞的增殖能力，抑制LM3細胞的遷移、侵襲，并增加LM3細胞的凋亡。表明HOXD10在HCC中發(fā)揮著抑癌因子的作用。
　　第三部分：HOXD10調(diào)控腫瘤發(fā)生作用機制的在體研究
　　目的：
　　通過構(gòu)建裸鼠HCC腫瘤模型，分析HOXD10對HCC腫瘤形成以及腫瘤生長速度的影

12、響。
　　方法：
　　SPF級BALB/C裸鼠共36只，裸鼠右側(cè)背部皮下，靠后側(cè)位置接種細胞，接種數(shù)量為2.5×107個/ml，0.2 ml/鼠，即每鼠接種5×106個活細胞；接種后每日觀察腫瘤的生長情況，每3 d測一次腫瘤的長徑與短徑，飼養(yǎng)40 d左右后，腫瘤成瘤明顯結(jié)束實驗，眼框采血并離心取血清凍存?zhèn)溆?，動物處死后拍照，腫瘤取出后拍照、稱重、量體積。
　　結(jié)果：
　　①接種LM3在7 d左右出現(xiàn)可檢測的腫瘤。

13、LM3-HOXD10組與LM3-GFP組、LM3組相比，腫瘤接種后第23日LM3-GFP組及LM3組的腫瘤體積出現(xiàn)差異。該結(jié)果表明在LM3細胞過表達HOXD10能夠顯著抑制瘤體的生長。
　?、诼闶蟪闪鰧嶒灲Y(jié)束后取瘤稱取腫瘤重量，與LM3-GFP以及LM3組相比，LM3-HOXD10組腫瘤的重量顯著低于LM3組，差異有統(tǒng)計學意義。表明在LM3細胞中過表達HOXD10能夠抑制瘤體的生長。
　　結(jié)論：
　　在體研究證實HOX