無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫耐受性及核轉(zhuǎn)錄因子NRF2信號(hào)通路的可能調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　無(wú)機(jī)砷及其化合物是國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確認(rèn)的人類(lèi)致癌物，據(jù)美國(guó)國(guó)家科學(xué)研究委員會(huì)(NRC)統(tǒng)計(jì)，全球受高砷暴露威脅的人口可達(dá)2億人。近年來(lái)慢性飲水砷中毒引起免疫系統(tǒng)功能的損傷逐漸成為研究的熱點(diǎn)，大量的流行病學(xué)數(shù)據(jù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)境砷暴露可以影響機(jī)體免疫器官的發(fā)育，破壞免疫器官的正常結(jié)構(gòu)等，最終導(dǎo)致機(jī)體的免疫監(jiān)視功能低下，為實(shí)質(zhì)器官腫瘤的發(fā)生提供了有利條件。因此探索無(wú)機(jī)砷暴露如何誘導(dǎo)免疫毒性，不僅可以為無(wú)機(jī)砷遠(yuǎn)

2、期致癌機(jī)制提供新的理論線索和靶點(diǎn)，也為臨床上推廣砷及其化合物治療自身性免疫疾病提供理論基礎(chǔ)和新的治療思路。
　　樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，對(duì)于維持正常機(jī)體免疫系統(tǒng)的自身穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)DCs表型和功能出現(xiàn)紊亂時(shí)，就會(huì)影響幼稚T淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而削弱機(jī)體正常的免疫監(jiān)視功能，誘發(fā)機(jī)體免疫無(wú)應(yīng)答和免疫抑制現(xiàn)象的發(fā)生，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提

3、供可乘之機(jī)。砷對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，然而砷如何通過(guò)影響DCs的表型和功能，改變幼稚T淋巴細(xì)胞的增殖分化，最終介導(dǎo)免疫毒性以及詳細(xì)的機(jī)制如何，查閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，我們雖然得到啟發(fā)但這些問(wèn)題并未闡明。因此本研究第一部分以小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞(bone marrowdendritic cells，BMDCs)為研究對(duì)象，觀察無(wú)機(jī)砷暴露如何影響B(tài)MDCs表型受體（協(xié)同刺激分子、抗原提呈分子和趨化粘附因子）、細(xì)胞因子和炎性通路(NF

4、-κB和MAPKs)的表達(dá)，以及混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而系統(tǒng)性闡明無(wú)機(jī)砷對(duì)BMDCs表型和功能的影響。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子NRF2通路除了發(fā)揮其經(jīng)典的抗氧化作用以外，還能抑制炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，間接調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。無(wú)機(jī)砷強(qiáng)烈誘導(dǎo)NRF2信號(hào)通路活化已經(jīng)在人永生化表皮角質(zhì)細(xì)胞HaCaT、膀胱上皮細(xì)胞UROtsa和巨噬細(xì)胞RAW264.7等細(xì)胞系中報(bào)道，然而關(guān)于無(wú)機(jī)砷能否通過(guò)引

5、起DCs中NRF2信號(hào)通路的活化，進(jìn)而調(diào)控DCs表型受體、細(xì)胞因子以及炎性通路表達(dá)的研究卻很少報(bào)道。SQSTM1/p62(Sequestosome1，SQSTM1)是一個(gè)能結(jié)合泛素的適配蛋白，在自噬和蛋白酶體依賴(lài)的細(xì)胞降解中發(fā)揮重要功能。最新的研究表明，p62的KIR序列能夠與NRF2競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合Keap1，進(jìn)而降低Keap1與NRF2的親和力，使NRF2信號(hào)通路被激活。因此，本研究第二部分通過(guò)建立體外BMDCs細(xì)胞NRF2信號(hào)通路活化

6、模型，觀察無(wú)機(jī)砷對(duì)NRF2信號(hào)通路的效應(yīng)情況，并且探討核轉(zhuǎn)錄因子NRF2通路在調(diào)控BMDCs表型受體、細(xì)胞因子以及炎性通路表達(dá)中的可能作用。另外，通過(guò)對(duì)BMDCs自噬流相關(guān)蛋白的檢測(cè)，探討無(wú)機(jī)砷是否通過(guò)p62-Keap1途徑激活NRF2信號(hào)通路，從而在無(wú)機(jī)砷介導(dǎo)BMDCs免疫毒性中發(fā)揮作用。
　　核轉(zhuǎn)錄因子NRF2通路作用的發(fā)揮，往往與其下游調(diào)控的一系列抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)密切相關(guān)。血紅素加氧酶-1（hemeoxygenas

7、e-1，HO-1）作為NRF2下游調(diào)控的Ⅱ相解毒酶，不僅在抗氧化方面發(fā)揮重要的作用，而且在抑制免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。除此之外，HO-1通過(guò)催化血紅素反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物CO也具有抗炎癥、抗凋亡、舒張血管等組織保護(hù)作用。因此，本研究第三部分通過(guò)對(duì)HO-1/CO系統(tǒng)進(jìn)行特異性干預(yù)后，觀察無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的HO-1/CO系統(tǒng)活化對(duì)BMDCs表型受體、細(xì)胞因子和炎性通路表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索HO/CO系統(tǒng)在無(wú)機(jī)砷介導(dǎo)的BMDCs免疫毒

8、性中的可能作用。
　　綜上所述，本研究以亞砷酸鈉為暴露因素，建立C57BL/6小鼠急性砷染毒動(dòng)物模型和原代誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠BMDCs體外染毒模型，通過(guò)觀察無(wú)機(jī)砷對(duì)BMDCs表型受體、細(xì)胞因子和炎性通路的影響，以及核轉(zhuǎn)錄因子NRF2及其下游的HO-1/CO系統(tǒng)在無(wú)機(jī)砷介導(dǎo)BMDCs免疫毒性中的可能作用，從而使我們更深層次的了解無(wú)機(jī)砷的免疫毒性作用，為研究無(wú)機(jī)砷遠(yuǎn)期致癌機(jī)制提供新的理論線索和靶點(diǎn)，以及臨床上推廣砷及其化合物治療自身性免疫

9、疾病提供理論基礎(chǔ)和新的治療思路。
　　研究方法:
　　本研究以C57BL/6小鼠和體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMDCs為研究對(duì)象，通過(guò)體內(nèi)體外無(wú)機(jī)砷染毒以及不同的干預(yù)措施，觀察和探究無(wú)機(jī)砷對(duì)BMDCs表型受體、細(xì)胞因子和炎性通路的影響，以及核轉(zhuǎn)錄因子NRF2及其下游的HO-1/CO系統(tǒng)在無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)BMDCs免疫毒性中的作用，具體研究方法如下:
　　1.BMDCs細(xì)胞活力測(cè)定:
　　收集BMDCs并計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組配制染

10、毒液。AsⅢ染毒2h后終濃度為25 ng/ml的LPS刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，24 h后每孔100μl培養(yǎng)基加20μl MTS試劑，37℃，5％ CO2的環(huán)境下孵育1-4 h。于全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀490 nm下讀取吸光度值。
　　2.BMDCs表型受體的流式檢測(cè):
　　收集急性砷暴露C57BL/6小鼠的脾臟單細(xì)胞懸液或者BMDCs單細(xì)胞懸液到15ml離心管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)并且調(diào)整細(xì)胞濃度，按照流式抗體說(shuō)明書(shū)的比例加入相應(yīng)流式抗體進(jìn)行雙標(biāo)實(shí)

11、驗(yàn)，室溫避光孵育40 min后用stain buffer重懸離心重復(fù)2次后，BD LSRFortessa型流式儀器上機(jī)檢測(cè)。
　　3.Real-time PCR分析基因轉(zhuǎn)錄活性
　　應(yīng)用Trizol法提取BMDCs總mRNA，利用GoScriptTM Reverse TranscriptionSystem試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。GoTaq(@)qPCR Master Mix試劑盒被用于實(shí)時(shí)定量PCR分析。采用ABI

12、 PRISM7500 Sequence Detector(AppliedBiosystems)進(jìn)行檢測(cè)后，進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
　　4.C57BL/6小鼠血清及BMDCs上清液細(xì)胞因子ELISA測(cè)定:
　　按照eBioscience試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，提前一天包被抗體，4℃過(guò)夜，按照說(shuō)明書(shū)經(jīng)1 x ELISAPOT進(jìn)行阻斷，用1 x ELISAPOT倍比稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白，同時(shí)加入解凍的樣本100μl/孔，封板，室溫孵育2

13、h。洗板3-5次，每孔加入100μlAvidin-HRP，封板，室溫孵育30 min。洗板3-5次，加入100μl1 x TMB substratesolution，室溫避光孵育15 min。洗板3-5次，加入50μl ELISA終止液，450 nm波長(zhǎng)讀數(shù)，分析數(shù)據(jù)。
　　5.單向混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞分型測(cè)定:
　　BMDCs與脾臟淋巴細(xì)胞按照比例進(jìn)行混合，于5％ CO2的環(huán)境下繼續(xù)孵育48h后，加入2

14、0μl MTS試劑，37℃，5％ CO2的環(huán)境下孵育1-4h，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀490 nm下讀取吸光度值，判定淋巴細(xì)胞增殖活力。
　　BMDCs與脾臟淋巴細(xì)胞按照1∶10比例進(jìn)行混合，于37℃、5％CO2的環(huán)境下繼續(xù)孵育48 h，收集細(xì)胞離心并用PBS洗2次后，再次離心加入100μl抗體稀釋液，同時(shí)按照流式抗體說(shuō)明書(shū)比例加入相應(yīng)的流式抗體，于室溫避光孵育40 min后，離心反復(fù)洗兩次后加入350μl抗體稀釋液上機(jī)檢測(cè)，判定淋巴細(xì)胞細(xì)胞

15、分型。
　　6.Western blot免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá):
　　按照論文中Western blot技術(shù)的詳細(xì)步驟，提取BMDCs蛋白后測(cè)定蛋白濃度，然后調(diào)節(jié)蛋白的上樣量，依次經(jīng)過(guò)配制凝膠、western blot電泳、轉(zhuǎn)膜、非特異性蛋白阻斷、一抗過(guò)夜和二抗孵育后，進(jìn)行ECL發(fā)光檢測(cè)NF-κB p65、p-IκB/IκB、Myd88、p-p38/p38、p-JNK/JNK、NRF2、HO-1、GCLM、LC3 A/B、SQ

16、STM1/p62、Keap1、LAMP2等蛋白的表達(dá)水平。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為Mean±SD，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異的顯著性檢驗(yàn);進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)(Fisher,s least significant difference t-test)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.無(wú)機(jī)砷抑制BMDCs表型受體的

17、表達(dá)
　　1μM AsⅢ染毒的BMDCs表面的突起較短，而且成熟度較高的BMDCs比例較少;非毒性濃度的無(wú)機(jī)砷劑量依賴(lài)性的抑制了LPS促成熟的BMDCs協(xié)同刺激分子(CD83、CD86、CD80和CD40)、抗原提呈分子MHCⅡ以及趨化粘附因子(CCR7、CCR5和ICAM-1)的表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);體內(nèi)無(wú)機(jī)砷染毒小鼠脾臟中BMDCs數(shù)量減少，并且MHCⅡ表達(dá)降低。
　　2.無(wú)機(jī)砷抑制BMDCs細(xì)胞因

18、子的表達(dá)
　　非毒性濃度的AsⅢ劑量依賴(lài)性的抑制BMDCs前炎癥因子（TNF-α和IL-1β）、Th1誘導(dǎo)型細(xì)胞因子(IL-12)、Th17誘導(dǎo)型細(xì)胞因子（IL-6和IL-23）蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄活性，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);上調(diào)Treg誘導(dǎo)型細(xì)胞因子(IL-10)蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的增加，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);抑制BMDCs介導(dǎo)的單向混合淋巴細(xì)胞的增殖能力，并且下調(diào)CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值的

19、升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.無(wú)機(jī)砷抑制BMDCs炎癥通路NF-κB和MAPKs的活化
　　非毒性濃度的AsⅢ劑量依賴(lài)性的抑制了BMDCs細(xì)胞NF-κB p65、p-IκB/IκB以及上游Myd88、p-p38/p38、p-JNK/JNK表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)BMDCs核轉(zhuǎn)錄因子NRF2通路活化
　　非毒性濃度的AsⅢ劑量依賴(lài)性的上調(diào)NRF2和HO

20、-1蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄活性的升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　5.無(wú)機(jī)砷和NRF2誘導(dǎo)劑tBHQ誘導(dǎo)BMDCs核轉(zhuǎn)錄因子NRF2通路活化
　　1μM AsⅢ和10μM tBHQ明顯誘導(dǎo)NRF2、GCLM和HO-1蛋白表達(dá)的明顯升高和Keap1表達(dá)的明顯降低，以及Gclc、Gclm和Hmox1轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　6.HO-1誘導(dǎo)劑CoPP和CO釋放分子CORM-2

21、誘導(dǎo)BMDCs細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性增加
　　CoPP明顯誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的增加，與COPP的作用相比，20μM和40μM CORM-2輕微上調(diào)了HO-1蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　7.無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的NRF2通路和HO-1/CO系統(tǒng)活化抑制BMDCs表型受體和細(xì)胞因子的表達(dá)
　　tBHQ、COPP和CORM-2明顯抑制了BMDCs協(xié)同刺激分子(CD83、CD8

22、6、CD80和CD40)、趨化粘附因子（CCR7、CCR5和ICAM-1）、炎性因子（TNF-α和IL-1β）、Th1誘導(dǎo)型細(xì)胞因子(IL-12)和Th17誘導(dǎo)型細(xì)胞因子（IL-6和IL-23）蛋白表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄活性的升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　8.無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的NRF2通路和HO-1/CO系統(tǒng)活化抑制BMDCs炎癥通路NF-κB和MAPKs的活化
　　與對(duì)照組相比，tBHQ、COPP和CORM-2抑制了

23、NF-κB p65、p-IκB/IκB以及上游Myd88、p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)
　　9.無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)BMDCs自噬溶酶體形成障礙的產(chǎn)生，并通過(guò)p62-Keap1依途徑誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子NRF2通路活化
　　不同濃度的無(wú)機(jī)砷劑量依賴(lài)性的抑制Keap1和LAMP2的表達(dá)，而誘導(dǎo)了自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。1μM

24、AsⅢ染毒的樹(shù)突狀細(xì)胞中可見(jiàn)大量自噬體積累，但并未觀察到溶酶體和自噬溶酶體的存在。
　　10.HO-1抑制劑ZnPP抑制無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的BMDCs細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)
　　不同濃度的ZnPP在6h和12h都可以劑量依賴(lài)性的抑制無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的HO-1蛋白的表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但對(duì)Hmox1的轉(zhuǎn)錄活性影響不明顯。
　　11.HO-1/CO系統(tǒng)低表達(dá)部分緩解無(wú)機(jī)砷對(duì)BMDCs表型受體和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄活性的抑制

25、作用
　　1μM AsⅢ抑制了趨化因子Ccr7、前炎癥因子Tnf和Th17誘導(dǎo)型細(xì)胞因子Il-6和Il-23轉(zhuǎn)錄活性，然而ZnPP可以劑量依賴(lài)性的緩解無(wú)機(jī)砷對(duì)BMDCs趨化因子Ccr7、前炎癥因子Tnf-α和Th17誘導(dǎo)型細(xì)胞因子Il-6和Il-23轉(zhuǎn)錄活性的抑制，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1)無(wú)機(jī)砷通過(guò)抑制BMDCs表型受體（協(xié)同刺激分子、趨化粘附因子）、細(xì)胞因子（前炎癥因子、Th1和

26、Th17誘導(dǎo)型細(xì)胞因子）和免疫相關(guān)通路(NF-κB和MAPKs)的表達(dá)，而特異性的增強(qiáng)Treg型細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，最終誘導(dǎo)BMDCs免疫耐受性。
　　2)無(wú)機(jī)砷通過(guò)誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子NRF2信號(hào)通路的活化，抑制BMDCs表型受體、細(xì)胞因子和免疫相關(guān)通路的表達(dá)，最終誘導(dǎo)BMDCs免疫耐受性。
　　3)無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)BMDCs的NRF2信號(hào)通路活化，可能與BMDCs自噬溶酶體形成障礙導(dǎo)致的SQSTM1/p62大量堆積有關(guān)。