油菜矮化突變體莖段伸長(zhǎng)初期莖尖差異表達(dá)基因的初步分析.pdf_第1頁(yè)
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1、“NDF-1”是利用快中子轟擊及硫酸二乙酯(DES)聯(lián)合處理甘藍(lán)型油菜高稈品系,然后再自交純合后育成的矮化突變體,其株高僅及親本的三分之一?!癗DF-1”在油菜抗倒伏及半矮稈雜交種選育中具有重要的作用。本文應(yīng)用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù)構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜矮化突變體“NDF-1”莖段伸長(zhǎng)初期的抑制性消減文庫(kù),對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,為探究油菜矮化突變的分子機(jī)理及克

2、隆該基因應(yīng)用于油菜品種基因工程改良奠定基礎(chǔ)。 首先,應(yīng)用SSH技術(shù),以矮稈突變株系“NDF-1”為Tester、高稈野生型“3529”為Driver,構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜矮化突變體“NDF-1”莖段伸長(zhǎng)初期莖尖的抑制性消減文庫(kù)。經(jīng)菌落PCR檢測(cè),消減文庫(kù)的有效重組率為58%,其中插入的cDNA片段大小在100 bp到500bp之間。通過(guò)斑點(diǎn)雜交對(duì)88個(gè)隨機(jī)挑選的含有插入片段的陽(yáng)性克隆進(jìn)行初步差異篩選,然后選取了30個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列

3、測(cè)定。除7個(gè)克隆未出現(xiàn)測(cè)序結(jié)果外,其余克隆均獲得了DNA序列結(jié)果。對(duì)cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較。其中13個(gè)有比較明確的比對(duì)結(jié)果:其中1個(gè)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),2個(gè)和植物抗病性有關(guān),1個(gè)和蛋白質(zhì)的泛素化降解有關(guān),1個(gè)和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);另外有8個(gè)克隆為功能未知的蛋白質(zhì)。 其次,在SSH文庫(kù)克隆序列分析的基礎(chǔ)上,以甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)矮化突變體“NDF-1”莖尖為材料提取RNA,采用RACE技術(shù)

4、對(duì)編碼幾丁質(zhì)酶基因的G6克隆的3’端片段進(jìn)行了RACE擴(kuò)增,獲得3’端片段序列長(zhǎng)度為344bp,在GenBank中進(jìn)行比對(duì)(blast)分析。結(jié)果表明,與幾丁質(zhì)酶基因核苷酸和蛋白質(zhì)同源性分別為86%和84%。根據(jù)G6克隆的已知序列設(shè)計(jì)特異引物并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和PCR技術(shù),檢測(cè)其在野生型與矮化突變體不同部位的差異表達(dá)。結(jié)果顯示,該基因僅在矮化突變體莖尖部位有比較明顯的表達(dá);在矮化突變體根、莖、子葉和成熟葉片部位無(wú)表達(dá);在野生型根

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