LncRNA h19在非小細胞肺癌中的表達及對細胞的生物學行為的影響.pdf

1、目的:肺部惡性腫瘤是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康、生活和生命威害最大的惡性腫瘤之一。根據全國腫瘤登記中心2014年最新研究顯示，全國男性肺癌的發(fā)病率為(1/105)49.27，在所有惡性腫瘤中位居第一位;女性肺癌的發(fā)病率為21.66，在所有惡性腫瘤中位居第二(乳腺癌25.89)。在全國城市中肺癌的發(fā)病率和死亡率為20.48和27.05均位居第一位;與此同時，在全國農村中肺癌的發(fā)病率和死亡率為18.50和22.42也均位居第一位。隨

2、著現在科技的進步以及各為研究者的深入研究，雖然對于肺癌的認識越來越深入，但是在肺癌的防治仍然是我們目前面臨的重大難題。好多肺癌患者在出現臨床癥狀的同時就醫(yī)，大多數已處于中晚期，因此研究肺癌的發(fā)病機制，尋找肺癌的分子生物學早期診斷指標，探討肺癌的治療靶標，不僅是在臨床具有重要的價值，更重要的是對于社會更有積極的意義。
　　肺部惡性腫瘤的從發(fā)生到發(fā)展是一個逐步積累的過程，一般是由于細胞生長過程中調控紊亂及生長方式的改變，從而引起細胞發(fā)

3、生癌前病變及基因改變。肺癌的發(fā)生是一個積累性的基因損傷，是一個多步驟、多基因參與的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、以及表觀調控、轉錄水平調控、轉錄后水平的紊亂，造成細胞組織器官失去原有的性質及作用對于人體造成損傷。LncRNA是以RNA的形式在多種層面上調控基因的表達水平，一般而言，越來越多的研究發(fā)現lncRNAs廣泛參與了基因組調節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移方面起著重要的作用。雖然長鏈非編碼RNAh19的異常表達與其他腫瘤的

4、發(fā)生，包括肝癌、卵巢癌、前列腺癌、大腸癌、乳腺癌，有著密切的關系[1-7]，但在非小細胞肺癌中的相關文獻尚不多見。因此，本研究旨在研究長鏈非編碼RNA h19在非小細胞肺癌中的異常表達對肺癌高危因素的相關性及對癌細胞的增殖、遷移及侵襲的影響。
　　方法:(1)收集64例手術治療患者中，術前診斷為非小細胞肺癌并未接受放化療，術后病理確診為非小細胞肺癌的患者，切除的新鮮癌組織及對應的癌旁組織;并將組織冰鹽水中清洗干凈并放入液氮中速凍2

5、4小時移至-80℃冰箱保存。(2)qRT-PCR檢測64例非小細胞肺癌中h19的表達情況:首先采用Trizol法提取癌組織及正常組織的總RNA;然后利用瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質量鑒定，確保RNA的完整性;再次設計lncRNA h19的反轉錄引物以及相應的上、下游引物，并且根據反轉錄試劑盒說明書的步驟進行反轉錄;最后應用qRT-PCR檢測長鏈非編碼RNA h19的表達情況。(3)根據各組的表達情況分析其與肺癌高危因素的相關性。(4)選取

6、肺癌細胞株A549進行細胞培養(yǎng)。(5)應用TRIZE方法提取非編碼長鏈RNA;利用瓊脂糖凝膠電泳進行對提取的RNA進行質量鑒定;設計lncRNA h19的反轉錄引物以及相應的上、下游引物，根據h19基因β-actin基因[8]使用引物設計軟件primerprimer5，分別參照GeneBank所刊登序列設計，以內參基因β-actin基因作為對照;再進行反轉錄，qRT-PCR來測定細胞株內表達h19的情況。(6)構建過表達的質粒載體:pC

7、DNA3.1-lncRNA h19;首先根據上述方法設計引物進行擴增，擴增結束后應用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，鑒定成功后構建真核表達載體pCDNA3.1-lncRNA h19，構建完成后使用雙酶切以及瓊脂糖凝膠電泳再次進行確定目的基因的真實性。(7)G418篩選穩(wěn)定表達A549細胞系:首先確定抗生素G418篩選濃度，然后篩選出較穩(wěn)定并且過表達lncRNAh19的細胞株A549-pCDNA3.1-lncRNAh19，并使用real-time

8、PCR技術來檢測目的基因表達水平，以確定細胞株是否已經建立成功。(8)對于過表達的A549-pCDNA3.1-lncRNAh19細胞株通過劃痕實驗來檢測細胞的遷移能力，并設置陰性對照組（只轉染空載體），設置空白對照組（加入轉染試劑）。(9)對于過表達的A549-pCDNA3.1-lncRNAh19細胞株通過MTT實驗進行檢測細胞的增殖能力，并以轉染空載體的陰性對照組及僅加入轉染試劑的空白對照組作為對比。(10)對于過表達的A549-pC

9、DNA3.1-lncRNAh19細胞株通過transwell小室實驗進行檢測細胞的侵襲能力，并設置陰性對照組（只轉染空載體），設置空白對照組（加入轉染試劑）。
　　結果:(1)lncRNA h19在非小細胞肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P＜0.05)(2)lncRNA h19在非小細胞肺癌中的表達與有無淋巴結轉移有關(P＜0.05)而與年齡、性別、有無吸煙史及腫瘤類型無相關性。(3)過表達lncRNAh19導致非小細胞肺癌細胞

10、的遷移、侵襲、增殖能力增加。
　　結論:(1)lncRNA h19在非小細胞肺癌中的表達明顯高于正常肺組織，提示其與腫瘤的發(fā)生有很大的關系，并且可能發(fā)生促癌基因的作用。(2)lncRNA h19在非小細胞肺癌中的表達與有無淋巴結轉移有相關性，與年齡、性別、有無吸煙史及腫瘤類型無相關性，提示lncRNA h19表達增高的腫瘤組織易發(fā)生淋巴結轉移。(3)過表達lncRNA h19導致細胞的遷移、侵襲、增殖性增加，提示lncRNA h1