hMOF調控非小細胞肺癌生物學行為及放射敏感性的研究.pdf

1、目的:近幾年來，肺癌的發(fā)病率及病死率均呈逐漸上升趨勢，是癌癥相關性死亡的首要原因。據(jù)統(tǒng)計，約有80％的肺癌患者的病理類型是非小細胞肺癌(non smallcell lung cancer，NSCLC)，大約70％的非小細胞肺癌患者在腫瘤治療期間接受了放射治療，腫瘤細胞放射敏感性在NSCLC的放療療效中起著重要的作用。因此，從分子水平深入認識肺癌的發(fā)生過程，篩選出獲得與肺癌發(fā)生發(fā)展及放療敏感性相關的功能性基因，為分子靶向治療提供新的靶點及

2、理論依據(jù)，對于肺癌的放射治療具有重要意義。
　　組蛋白的乙?；欣诤诵◇w結構松弛，從而暴露出DNA特異性結合位點，以利于各種轉錄因子和協(xié)同轉錄因子與其結合，激活基因的轉錄。而組蛋白的去乙?；瘎t發(fā)揮相反的作用。hMOF(human males absent on the first)作為乙?；M蛋白H4K16的關鍵酶，參與了許多重要的細胞活動，在細胞內的功能具有多樣性和廣泛性。實驗研究證明，沉默hMOF之后引起H4K16ac的減少

3、，可引起基因轉錄的異常，基因組不穩(wěn)定，自發(fā)的染色體畸變，細胞周期功能缺陷和形態(tài)的改變，及致癌基因或抑癌基因的異常表達，最近研究發(fā)現(xiàn)hMOF在乙?；M蛋白的同時，也與非組蛋白的乙?；嘘P，如P53、Nrf2等蛋白的乙?；瑥亩鴧⑴c到細胞周期調控、DNA損傷修復的過程中來。DNA是電離輻射的主要靶分子，DNA損傷修復能力的水平是影響放射敏感性的重要因素。在分子腫瘤學的研究中發(fā)現(xiàn)，與DNA修復功能相關的基因突變、多態(tài)性及表觀修飾均可引起細胞放

4、射敏感性的改變。目前對于hMOF在Ⅲ期非小細胞肺癌放療患者中的表達情況對預后的影響，及hMOF的表達是否能夠影響非小細胞肺癌細胞的放射敏感性，至今沒有研究報道。
　　研究方法:1、收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術切非小細胞肺癌組織及其配對正常肺組織24例，提取RNA及蛋白，采用Realtime-PCR和Western Blot方法檢測分析肺癌組織及其正常肺組織中hMOF的mRNA和蛋白的表達情況。收集90例接受根治性放射治療的Ⅲ期

5、非小細胞肺癌患者的腫瘤組織標本（纖支鏡或者介入下穿刺取得的癌組織）。利用免疫組化檢測hMOF在Ⅲ期非小細胞肺癌組織中的表達情況，分析hMOF的表達情況與臨床病理因素及預后的相關性。2、采用Westernblot方法檢測非小細胞肺癌細胞系H460、A549、H1299細胞系中hMOF蛋白的內源性表達情況。通過慢病毒轉染非小細胞肺癌細胞系H1299和A549細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉染沉默hMOF的細胞。采用Western blot方法

6、檢測轉染后以上兩種細胞表達hMOF基因編碼蛋白情況。采用劃痕愈合實驗、Transwell遷移、侵襲實驗評價hMOF基因對NSCLC細胞系H1299和A549細胞遷移、侵襲能力的影響。采用MTT法評估沉默hMOF對NSCLC細胞系H1299和A549細胞增殖活性的影響。通過裸鼠皮下移植瘤實驗評估沉默hMOF的非小細胞肺癌細胞系H1299體內增殖能力。采用Western blot方法評價hMOF基因對Akt信號通路的影響。3、采用平板克隆形

7、成實驗評估hMOF基因對細胞放射敏感性的影響;通過多靶單擊模型繪制存活曲線，計算D0、Dq、SER等放射敏感性相關指標，評價沉默hMOF后對NSCLC細胞系H1299、A549細胞的增敏效果;通過Western blot方法評價hMOF基因沉默對p-ATM及RAD51蛋白的影響。4、實驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件分析，計量資料采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法進行比較，檢驗水平F=0.05，2組計量資料采用t檢

8、驗或t'檢驗進行比較，檢驗水平α=0.05，計數(shù)資料采用行×列表的x2檢驗或Fisher精確檢驗，檢驗水平α=0.05。
　　結果:1、通過Realtime-PCR、Western Blot方法對24例非小細胞肺癌組織及配對正常肺組織中hMOF表達情況進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)hMOF蛋白在NSCLC組織中的mRNA和蛋白表達量顯著高于配對正常肺組織，P＜0.05。2、90例Ⅲ期非小細胞肺癌放療患者的肺癌組織病理切片經(jīng)免疫組織化學染色，發(fā)

9、現(xiàn)有46例為hMOF高表達。hMOF的表達情況與腫瘤的N分期情況具有相關性。經(jīng)過生存分析發(fā)現(xiàn)hMOF低表達患者的中位生存期為28個月，5年生存率22.9％。hMOF高表達患者中位生存期為20個月，5年生存率5.4％。與未接受同步放化療的患者相比，接受同步放化療患者的中位生存時間顯著延長，1年、3年、5年生存率顯著升高，P＜0.05。hMOF的表達情況、放化療情況以及N分期情況是Ⅲ期非小細胞肺癌放療患者的獨立預后因素，對預后的相對危險度分

10、別為hMOF的表達情況:1.811，放化療情況:1.968，N分期:1.799。3、通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)沉默hMOF基因可抑制非小細胞肺癌細胞增殖活性，通過Transwell和細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)沉默hMOF基因抑制癌細胞遷移、侵襲。裸小鼠皮下成瘤實驗結果顯示，與對照組相比，hMOF基因沉默后可抑制非小細胞肺癌H1299細胞皮下移植瘤的生長，P＜0.05。4、沉默hMOF下調了p-AKT的表達。5、根據(jù)平板克隆形成實驗的結果進一步擬合劑量存活

11、曲線發(fā)現(xiàn)沉默hMOF能后夠提高H1299和A549的放射敏感性，增敏比分別為1.22和1.34。6、通過Western Blot實驗檢測結果顯示與空載組相比，沉默hMOF基因后p-ATM及RAD51表達水平下降。
　　結論:1、與正常肺組織相比，NSCLC組織中hMOF的mRNA及蛋白表達顯著升高。Ⅲ期NSCLC放療患者的hMOF表達情況與預后相關，高表達者預后差。接受同步放化療的患者較未接受同步放化療的患者預后好。hMOF的表達