胸腺肽β4基因的克隆表達(dá)及活性測(cè)定.pdf

1、胸腺肽β4(thymosin β4，Tβ4)是存在于多種動(dòng)物的多種組織中的一種酸性肽，分子量為4982，PI為5.1，N端絲氨酸被乙?；?，它的cDNA序列和氨基酸序列已明確，含有2個(gè)a螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于第4-16和第30-40氨基酸殘基之間，這種結(jié)構(gòu)與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合相關(guān)。Tβ4在人和許多哺乳動(dòng)物如羊、豬、牛、老鼠及其他脊椎動(dòng)物如鳥類、兩棲類的體內(nèi)廣泛分布，具有多方面的生物學(xué)活性。Tβ4是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體免疫機(jī)能，促

2、進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟、內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)和附著、血管生成、神經(jīng)再生、腫瘤轉(zhuǎn)移、心肌修復(fù)、創(chuàng)傷愈合和抗炎癥反應(yīng)等。 本研究的目的是通過基因工程方法，將Tβ4基因克隆至表達(dá)載體pTXB1，在大腸桿菌中表達(dá)Tβ4，并將表達(dá)的Tβ4進(jìn)行分離、純化及生物學(xué)活性測(cè)定，以期獲得能夠高效表達(dá)、純化簡便的制備Tβ4方法。取得如下結(jié)果。 1.從Genebank中查得Tβ4 eDNA，將Tβ4基因序列的正義鏈和反義鏈拆分成10個(gè)互補(bǔ)的小片段，互為模板，由

3、生物公司合成的10個(gè)互補(bǔ)的小片段，采用PCR兩步法擴(kuò)增出Tβ4全基因。根據(jù)Tβ4基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)帶有pTXB1的酶切位點(diǎn)—NdeⅠ和XhoⅠ的特異性引物，用此特異性引物擴(kuò)增出Tβ4基因，然后將擴(kuò)增出的目的片段連接至pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E．coli DH5a感受態(tài)，通過陽性克隆篩選、酶切鑒定、測(cè)序、基因比對(duì)，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-Tβ4。 2.將pMD18-T-Tβ4與原核表達(dá)載體pTXB1用NdeⅠ和Xh

4、oⅠ雙酶切，pMD18-T-Tβ4被酶成兩個(gè)片段，較小的片段為Tβ4基因片段，pTXB1被酶切為兩個(gè)片段，較大的片段為目的片段。凝膠回收pMD18-T-T134酶切的小片段和pTXB1被酶切后的大片段，將回收的片段用連接試劑盒連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E．coli DH5a感受態(tài)進(jìn)行陽性克隆篩選、酶切鑒定、基因測(cè)序、測(cè)序結(jié)果分析，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTXB1-Tβ4。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21 codon plus，用異丙基-β-D

5、-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物。 3.將表達(dá)產(chǎn)物超聲裂解、幾丁質(zhì)(Chitin beads)柱親和層析純化，再經(jīng)Tricine—SDS—PAGE鑒定表明，融合蛋白Tβ4在E．coli BL21 codon plus中已經(jīng)高效表達(dá)，并獲得較純的重組Tβ4。將純化產(chǎn)物用HiTrap Desalting脫鹽柱脫鹽、真空離心濃縮儀真空抽干、稱重后，用PBS溶解Tβ4，BCA試劑盒測(cè)Tβ4濃度。最后用MT