蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒腺cDNA文庫(kù)抗菌肽基因篩選及表達(dá).pdf

1、昆蟲(chóng)抗菌肽是昆蟲(chóng)對(duì)入侵病原微生物免疫應(yīng)答反映的效應(yīng)物，當(dāng)受到微生物侵染時(shí)，其脂肪體和血細(xì)胞等中會(huì)產(chǎn)生一類(lèi)小分子物質(zhì)，并迅速釋放到血淋巴中抵抗微生物入侵。它們大多是陽(yáng)離子肽，分子量小，有廣泛的殺菌譜，對(duì)細(xì)菌等病原菌、甚至腫瘤細(xì)胞和病毒也有抑殺作用，有望發(fā)展成為新一代肽類(lèi)抗生素。目前，在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目和等翅目中發(fā)現(xiàn)200多種昆蟲(chóng)抗菌肽，而金小蜂體內(nèi)抗菌物質(zhì)的研究幾近空白。本文以蝶蛹金小蜂毒腺為材料，構(gòu)建了cDNA文庫(kù)

2、，對(duì)抗菌肽基因進(jìn)行篩選，克隆到了新型抗菌肽基因，并將其在不同原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，初步測(cè)定其抑菌活性。結(jié)果如下： 1.以蝶蛹金小蜂Ptermalus puparum毒腺為材料，構(gòu)建了毒腺cDNA文庫(kù)。通過(guò)X-gal顯色原理測(cè)定藍(lán)白斑數(shù)量，文庫(kù)的重組率為97.6％。對(duì)原始文庫(kù)進(jìn)行滴度檢測(cè)，結(jié)果為8.95×104 pfu/ml，擴(kuò)增后的滴度為3.1x107 pfu/ml。對(duì)隨機(jī)挑選的噬菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1％瓊脂糖凝膠電泳下顯示外源插

3、入cDNA片段大小在0.3～1.6 kb之間。文庫(kù)質(zhì)量鑒定結(jié)果表明，此文庫(kù)具有較好的庫(kù)容量、較高的重組率及較大的插入片段。 2.采用基于cDNA表達(dá)文庫(kù)的昆蟲(chóng)源抗菌肽基因的高效克隆篩選技術(shù)。對(duì)上述文庫(kù)大批量的篩選和重復(fù)涂板驗(yàn)證后，得到3個(gè)有一定抑菌效果的陽(yáng)性克隆。對(duì)其進(jìn)行核苷酸測(cè)序，得到的核苷酸序列用BLASTn軟件在GenBank非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)和AMP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源性很高的序列，推斷所得克隆是新型抗菌肽基因。

4、 3.將含信號(hào)肽序列的PP2a和不含信號(hào)肽的PP2b基因在兩種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pET28a/BL21和pGEX-4T-2/BL21中進(jìn)行表達(dá)。在pET28a/BL21系統(tǒng)中，獲得了高效表達(dá)的融合蛋白His-PP2a；在pGEX-4T-2/BL21系統(tǒng)中，獲得了高效表達(dá)的融合蛋白GST-PP2b和主要以包涵體形式存在的GST-PP2a。并用抗His抗體和抗GST抗體的Western印跡分析證實(shí)了上述融合蛋白的表達(dá)。對(duì)這些蛋白粗提液