抗GPC3抗體的篩選及其抗肝細(xì)胞腫瘤活性研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3；GPC3）在原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma；HCC）、癌旁慢性淺表性胃炎組織中表達(dá),而在膽管細(xì)胞癌和良性肝病以及正常肝組織中無(wú)表達(dá)。因此，GPC3成為臨床診斷和治療的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。與原核細(xì)胞展示型抗體庫(kù)相比，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜展示型抗體庫(kù)進(jìn)行抗體的篩選獲得的修飾后單鏈抗體(Single Cha

2、in Fragment Variable；scFv)具有更好的特異性和低免疫原性。與單鏈抗體相比，全長(zhǎng)抗體具有穩(wěn)定性高和半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn)，其具有Fc段（Fragment Crystallizable）可與含有Fc段的靶細(xì)胞結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞免疫，同時(shí)也可激活補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。因此，全長(zhǎng)全人源的抗GPC3抗體在原發(fā)性肝癌的診斷和治療上具有巨大的潛力。
　　第一部分：全人源肝癌 scFv抗體庫(kù)的建立
　　在本實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)

3、胞膜展示型scFv抗體庫(kù)[1]的基礎(chǔ)上，增加9例肝癌病人血樣進(jìn)行scFv抗體庫(kù)的擴(kuò)庫(kù)。其主要流程為：1）提取病人外周血中的淋巴細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），并從其中提取總核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）；2）以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸（complementary DNA，cDNA）；3）通過(guò)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)輕重鏈引物，以cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶

4、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)獲得輕重鏈抗體的可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH；variable region of light chain，VL）；4）通過(guò)重疊PCR（overlap extention PCR）將輕重鏈基因序列連接在一起，形成單鏈抗體；5）構(gòu)建pDisplay-scFv質(zhì)?？贵w庫(kù)。將肝癌pDisplay-scFv抗體庫(kù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取單

5、克隆進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行肝癌scFv抗體庫(kù)的活性、多樣性的鑒定和庫(kù)容量的估算。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western Blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)肝癌pDisplay-scFv抗體庫(kù)質(zhì)粒的表達(dá)進(jìn)行鑒定。綜上所述，我們構(gòu)建了一個(gè)具有活性和多樣性、庫(kù)容量約為6.4×104、可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面進(jìn)行表達(dá)的肝癌pDisplay-scFv抗體庫(kù)。
　　第二部分：流式細(xì)胞分選
　　將抗體庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，通過(guò)FITC標(biāo)記的GPC3蛋白

6、對(duì)表達(dá)GPC3 scFv抗體的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選。通過(guò)肝癌scFv抗體庫(kù)與非肝癌scFv抗體庫(kù)的流式細(xì)胞分選進(jìn)行比較，證明增加肝癌scFv抗體庫(kù)的庫(kù)容量有利于GPC3 scFv抗體的分選。采用三輪流式細(xì)胞分選，利用GPC3蛋白濃度的梯度遞減（10 nM、5 nM、1 nM）來(lái)獲得親和力更高的scFv候選序列。獲得的候選序列與已有序列的同源性為85％-95%。
　　第三部分：抗GPC3全長(zhǎng)抗體的構(gòu)建
　　將輕重鏈序列構(gòu)建進(jìn)入HX

7、T1以及HXT2載體，完成HXT1-VH和HXT2-VL表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。將HXT1-VH和HXT2-VL質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞后，取細(xì)胞上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定抗體大小；通過(guò)Western Blotting鑒定抗體為IgG型抗體；采用Protein A親和柱層析法進(jìn)行抗體的純化。
　　第四部分：抗體的活性評(píng)價(jià)
　　通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent ass

8、ay，ELISA)證明抗體與GPC3具有結(jié)合活性；使用NTA sensor通過(guò)Fortebio測(cè)得GPC3蛋白與抗體的親和常數(shù)（KD）約為1.4×10-6 M。采用不同濃度（0μg/mL，40μg/mL，200μg/mL）的抗體孵育Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。采用0μg/mL和150μg/mL的抗體孵育Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。采用0μg/mL和100μg/mL的抗體孵育Huh-7細(xì)胞

9、和HepG2細(xì)胞后進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抗體對(duì)Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞具有抑制其增殖、遷移和黏附的作用；調(diào)控Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期；促進(jìn)Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用150μg/mL的抗體孵育Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)增殖、凋亡、遷移和黏附等關(guān)鍵分子的基因和靶基因mRNA水平的變化。qPCR結(jié)果顯示，MMP2、MMP9、HGF等表型基因的表達(dá)水平受到不同程

10、度的抑制，從而在mRNA水平驗(yàn)證了細(xì)胞水平的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　第五部分：抗體作用機(jī)制的初步探索
　　1）抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC）
　　以PBMC細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，使用200μg/mL的濃度孵育Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞12h后進(jìn)行活細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示，抗體組PBMC對(duì)Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞具有明顯

11、殺傷效果。
　　2）Wnt信號(hào)通路
　　使用150μg/mL的抗體孵育Huh-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，檢測(cè)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA水平的變化。qPCR結(jié)果顯示，抗體對(duì)GPC3和β-catenin基因的表達(dá)水平有抑制作用但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)Wnt3α和Wnt1基因的表達(dá)水平具有明顯的抑制作用。經(jīng)過(guò)對(duì)GPC3、Wnt3α和β-catenin的Western Blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述mRNA水平表達(dá)結(jié)果。目前，初步推斷抗