抗人整合素β3亞基單克隆抗體及其單鏈抗體的制備和抗腫瘤活性的研究.pdf

1、【目的】制備抗人整合素β3亞基的單克隆抗體，研究其對腫瘤治療的作用。并在此單抗的基礎上，為降低鼠源性單抗的異種抗原性和高分子量，應用基因工程抗體技術制備抗人整合素β3亞基單鏈抗體(ScFv)，為進一步研究整合素β3抗體在腫瘤診斷和治療中的作用奠定基礎。 【方法】從人白細胞中提取總RNA，用人B3胞膜外基因的引物，以RT—PCR的方法擴增人B3胞膜外基因，將其克隆至原核表達載體pQE30中，獲得含B3胞膜外基因的高效表達載體pQE

2、30-β3，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，用IPTG誘導表達，對表達產(chǎn)物進行純化，獲得B3蛋白。將此蛋白免疫BALB/c小鼠，應用B淋巴細胞雜交瘤技術制備抗人整合素β3亞基的單克隆抗體(mAb),通過小鼠體內(nèi)抑制黑色素瘤生長實驗和體外抑制HUVEC細胞增殖及促進HUVEC細胞凋亡的實驗篩選出具有抑制腫瘤生長作用的單抗。并從分泌此單抗的雜交瘤細胞中提取總RNA，用小鼠抗體可變區(qū)基因的通用引物，以RT—PCR的方法擴增出抗B3抗體的重鏈可變區(qū)(v

3、H)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，再通過PCR的方法在VH和VL基因間插入柔性連接子(G1y4Ser)3，構(gòu)建出抗β3抗體的ScFv基因。將其克隆至原核表達載體pQE30中，獲得抗β3單鏈抗體基因的高效表達載體pQE30-β3-ScFv，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，用IPTG誘導表達，對表達產(chǎn)物進行純化和凝膠柱上在位復性，用EUSA的方法鑒定其結(jié)合β3抗原活性。 【結(jié)果】擴增獲得了β3胞膜外基因，構(gòu)建了β3蛋白的原核表達載體，表達純化了β3

4、蛋白，成功制備了8株抗人整合素β3亞基的單克隆抗體。經(jīng)過體內(nèi)和體外實驗篩選出一株具有顯著抑制腫瘤生長的單抗4F12。通過基因工程抗體技術獲得4F12抗體的VH和VL基因，并構(gòu)建出抗β3抗體的ScFv基因，在大腸桿菌中獲得了表達，表達蛋白相對分子質(zhì)量約為26×103，主要以包涵體形式存在。經(jīng)金屬螯合親和層析柱(Ni-NTAagarose)純化和凝膠柱上在位復性后，EUSA結(jié)果證實其具有良好的結(jié)合β3抗原活性。 【結(jié)論】成功地獲得了