封裝VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠負(fù)荷內(nèi)皮祖細胞修復(fù)大鼠皮膚創(chuàng)面的實驗研究.pdf

1、第一部分、海藻酸鈉凝膠的制備及對成血管因子的封裝
　　目的：設(shè)計并合成具有一定生物活性的海藻酸鈉凝膠，觀察其顯微結(jié)構(gòu)；并封裝成血管生長因子VEGF和bFGF，測定并比較海藻酸鈉對這兩種生長因子的釋放規(guī)律。
　　方法：購買天然的高分子量及低分子量海藻酸鈉大分子，通過高碘酸鈉氧化修飾法部分氧化海藻酸鈉分子；氧化型的高分子量及低分子量海藻酸鈉溶解后，按照1:1等體積混合后，在二價鈣離子的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成凝膠，掃描電鏡下觀察其

2、顯微結(jié)構(gòu)；同時加入VEGF及bFGF一起形成凝膠，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗測定兩種因子的釋放規(guī)律。
　　結(jié)果：成功合成了海藻酸鈉凝膠，并完成了凝膠對VEGF及bFGF的封裝。掃描電鏡下顯示凝膠內(nèi)部呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙直徑在10μm左右；ELISA結(jié)果顯示：短時程內(nèi)，兩種生長因子都平穩(wěn)緩慢釋放，在24h時釋放率達到20％左右；長時程內(nèi)，兩種生長因子釋放速度也較平穩(wěn)，第七天時釋放速度明顯加快，釋放率達到85%左右。采用配對資料的t檢驗發(fā)現(xiàn)

3、，海藻酸鈉凝膠對兩種生長因子的釋放率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：海藻酸鈉能夠形成凝膠，而且能封裝生長因子VEGF和bFGF；封裝后，能較平穩(wěn)釋放生長因子，在一周左右有一個釋放高峰；海藻酸鈉能保證兩種生長因子的協(xié)同釋放。
　　第二部分、內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)鑒定及與海藻酸鈉凝膠的負(fù)荷
　　目的：分離培養(yǎng)大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞，觀察內(nèi)皮祖細胞的生物特點，并鑒定其表面標(biāo)志物；用海藻酸鈉凝膠封裝VEGF及bFGF，同時負(fù)荷內(nèi)皮祖

4、細胞共培養(yǎng)，觀察海藻酸鈉凝膠對內(nèi)皮祖細胞生長的影響。
　　方法：分離SD大鼠骨髓，采用密度梯度離心法獲得單個核細胞；用EGM培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，根據(jù)差速貼壁原理，分別獲得早、晚期內(nèi)皮祖細胞；倒置顯微鏡下觀察兩種內(nèi)皮祖細胞的原代生長規(guī)律；晚期內(nèi)皮組細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后采用流式細胞術(shù)檢測其表面標(biāo)記 CD34及 VEGFR2的陽性率，免疫熒光法觀察這兩種表面分子的染色情況。使用封裝有VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠負(fù)荷內(nèi)皮祖細胞，使用細胞計數(shù)法

5、觀察內(nèi)皮祖細胞單獨培養(yǎng)及與凝膠共培養(yǎng)時的生長速度。
　　結(jié)果：我們成功分離培養(yǎng)了大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞：早期內(nèi)皮組細胞在種植兩天后貼壁，四天左右開始出現(xiàn)“集落”，一周時觀察到典型的“內(nèi)皮祖細胞集落”，其特點是中央為大量圓球形細胞，周圍梭形細胞呈放射狀排列；晚期內(nèi)皮祖細胞在第五日二次貼壁后呈圓球形，之后大量擴增，兩周時達到80%融合，呈典型的“鋪路石”樣外觀。免疫熒光檢測顯示內(nèi)皮祖細胞VEGFR染色較強，而CD34分子染色較弱；流

6、式細胞術(shù)檢測顯示VEGFR2和CD34雙陽性細胞比例為（1.50±0.04）%；VEGFR2單陽性細胞比例為（18.50±0.12）%；CD34單陽性細胞比例為（2.41±0.08）%。細胞生長曲線測試顯示與單純內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)相比，海藻酸鈉凝膠共培養(yǎng)使細胞增殖更平穩(wěn)，增殖期延長。
　　結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁原理能夠獲得穩(wěn)定傳代的大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞，為后續(xù)的組織工程研究提供“種子細胞”；海藻酸鈉凝膠與內(nèi)皮祖細胞有良好的

7、生物相容性，與VEGF及bFGF一起可以促進內(nèi)皮祖細胞的生長和增殖。
　　第三部分、封裝成血管因子VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠負(fù)荷內(nèi)皮祖細胞在大鼠皮膚創(chuàng)面模型中促血管生成的效果的觀察
　　目的：觀察封裝成血管因VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠，負(fù)荷大鼠內(nèi)皮祖細胞在大鼠皮膚創(chuàng)面模型中促血管生成的效果，并探討其可能的機制。
　　方法：取SD大鼠24只，隨機分為A、B、C、D四組，設(shè)計大鼠背部創(chuàng)面模型；A組大鼠背部創(chuàng)面移

8、植單純的海藻酸鈉凝膠，B組大鼠背部創(chuàng)面移植封裝有VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠，C組大鼠背部創(chuàng)面移植負(fù)荷有內(nèi)皮祖細胞的海藻酸鈉凝膠，D組大鼠背部創(chuàng)面移植封裝有VEGF及bFGF、同時負(fù)荷內(nèi)皮祖細胞的海藻酸鈉凝膠。連續(xù)大體觀比較創(chuàng)面愈合的基本情況；術(shù)后7天時，活體成像顯微鏡下觀察各組大鼠創(chuàng)面血管密度及血液供應(yīng)的基本情況；處死大鼠并分離創(chuàng)面組織，HE染色觀察創(chuàng)面的組織變化情況；免疫熒光法檢測各組創(chuàng)面 Ang-1及 VEGFR抗原的表達情況

9、；實時熒光定量 PCR檢測創(chuàng)面組織中 PECAM1、VE-cadherin、Flk-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：大體觀見D組大鼠創(chuàng)面造模后4天傷口已明顯干燥、結(jié)痂，在術(shù)后一周時形成了一層痂皮保護層，顯示創(chuàng)面愈合較其他組快；
　　活體成像顯微鏡結(jié)果示 A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面血管平均計數(shù)依次分別為（條）：4.0±0.8；12.5±1.3；14.0±0.8；27.8±2.5。A組的血管數(shù)與B、C、D組對比有統(tǒng)計學(xué)差異（

10、P＜0.05）；D組的血管數(shù)與B、C組對比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面的平均血流速度依次分別為（μm/秒）：41.60±1.76；53.45±1.67；55.03±1.50；64.88±2.12。A的血流速度與 B、C、D組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；B、C組與D組對比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　免疫熒光法顯示D組熒光強度最高。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)

11、面組織中PECAM的mRNA相對表達量依次為0.198±0.021；0.393±0.027；0.409±0.019；0.805±0.017。A組與B、C、D組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；B、C組與D組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　四組的VE-cadherin mRNA相對表達量依次為0.479±0.008；0.507±0.007；0.494±0.005；0.871±0.023。D組與A、B、C組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A、B

12、、C三組之間相互對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　四組的Flk-1 mRNA相對表達量依次為0.186±0.017；0.406±0.010；0.404±0.008；0.690±0.020。A組與B、C、D組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；B、C組與D組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：封裝VEGF及bFGF的海藻酸鈉凝膠，同時負(fù)荷內(nèi)皮祖細胞用于大鼠背部創(chuàng)面的損傷修復(fù)，在宏觀上可以促進創(chuàng)面的結(jié)痂及炎癥反應(yīng)的消退