VASN蛋白的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver，PCL)是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高，是現(xiàn)代人類(lèi)健康的巨大威脅。尤其在我國(guó)，肝癌的發(fā)病率與死亡率均位居世界前列，并且呈不斷上升趨勢(shì)。原發(fā)性肝癌種類(lèi)很多，主要分為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝胚細(xì)胞癌(hepatoblastoma)、膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma)和肉瘤(sarcoma)等，其

2、中，肝細(xì)胞癌占肝癌的90％以上。
　　肝癌的早期診斷、早期治療對(duì)患者的預(yù)后及存活時(shí)間至關(guān)重要。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是1965年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的第一個(gè)具有診斷價(jià)值的肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物，也是現(xiàn)有診斷原發(fā)性肝癌的主要臨床標(biāo)志物之一，但是，大量的臨床數(shù)據(jù)卻發(fā)現(xiàn)，部分肝硬化患者AFP檢測(cè)長(zhǎng)期呈陽(yáng)性，也仍約有30％以上肝癌患者血清AFP檢測(cè)呈陰性。近年來(lái)，一些肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路得以闡釋清楚，但是，肝癌早

3、期診斷難，晚期預(yù)后差的情況并沒(méi)有改變。因此，更加深入地了解肝癌的分子機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物和診斷、治療靶點(diǎn)的需求仍然迫在眉睫。
　　我們?cè)谇捌谘芯恐?，運(yùn)用消減EMSA-SELEX(Systematic Evolution ofLigands by EXpotential Enrichment)技術(shù)，從伴肝外轉(zhuǎn)移的血清AFP陰性肝細(xì)胞癌患者血清中篩選出候選標(biāo)志物分子——VASN(Vasorin，slit like2)蛋白，并通過(guò)實(shí)

4、驗(yàn)證實(shí)了VASN在肝癌組織、肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均高于正常肝組織和正常肝細(xì)胞，且VASN高表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移有明顯的促進(jìn)作用。本課題的主要研究?jī)?nèi)容就是進(jìn)一步對(duì)肝癌中VASN的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討，課題主要分為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分:VASN通過(guò)外泌體影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical veinendothelial cells，HUVEC)的遷移。
　　VASN是一個(gè)典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，受去

5、整合素-金屬蛋白酶17(ADAMmetallopeptidase domain17，ADAM17)剪切，分泌至血管循環(huán)中，發(fā)揮TGF-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)結(jié)合蛋白的作用。主要表達(dá)在動(dòng)脈和富含血管的胎盤(pán)與腎臟等器官中。但VASN在正常肝組織、肝細(xì)胞中表達(dá)量很低，在肝癌組織、肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。這說(shuō)明VASN與肝癌發(fā)生發(fā)展有可能有密切關(guān)系。
　　我們首先探索了VASN與血管內(nèi)

6、皮細(xì)胞之間的聯(lián)系。VASN的蛋白結(jié)構(gòu)表明細(xì)胞表達(dá)的VASN可以分泌至細(xì)胞外。我們檢測(cè)了HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)上清，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中含有大量的分泌型VASN。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清與HUVEC共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后HUVEC中VASN的蛋白含量升高，而HUVEC中VASN的mRNA含量沒(méi)有發(fā)生變化，提示HUVEC中含量上升的VASN蛋白可能來(lái)自于外源肝癌細(xì)胞的分泌。
　　為了找到VASN在胞外的存在形式與功能方式，我們從細(xì)胞培養(yǎng)上

7、清中純化得到外泌體，并對(duì)外泌體及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VASN進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體中能檢測(cè)到VASN，培養(yǎng)上清中也能檢測(cè)到VASN，除去培養(yǎng)上清中的外泌體后VASN的含量明顯下降。以上結(jié)果證明VASN能夠存在于外泌體中。
　　檢測(cè)不同肝細(xì)胞系外泌體VASN后發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞HepG2的外泌體VASN明顯高于正常肝細(xì)胞L02與HUVEC的外泌體VASN。這與細(xì)胞內(nèi)VASN的表達(dá)差異一致。這說(shuō)明不同細(xì)胞外泌體VASN的含量與不同細(xì)胞中V

8、ASN的表達(dá)差別是一致的。收集HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體，濃縮后以高濃度加入HUVEC培養(yǎng)基共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)同樣能在HUVEC細(xì)胞中檢測(cè)到VASN。
　　為了進(jìn)一步證明外泌體VASN的轉(zhuǎn)運(yùn)，我們?cè)贖epG2中過(guò)表達(dá)帶myc標(biāo)簽的VASN，純化收集帶有myc標(biāo)簽的外泌體，隨后將帶myc標(biāo)簽的外泌體與HUVEC細(xì)胞孵育進(jìn)行免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶標(biāo)簽的外源VASN能在HUVEC細(xì)胞被檢出。這表明，HUVEC中VASN水平

9、的升高確實(shí)是攝取HepG2來(lái)源的外泌體VASN而產(chǎn)生的。
　　我們將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清及HepG2來(lái)源的外泌體與HUVEC共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠引起HUVEC遷移加快，但HUVEC增殖水平未見(jiàn)明顯變化。這說(shuō)明了，HepG2來(lái)源的外泌體可作用于靶細(xì)胞并引起靶細(xì)胞功能改變。隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)改變HepG2細(xì)胞的VASN水平，從而改變外泌體中VASN的含量。用VASN含量不同的外泌體與靶細(xì)胞HUVEC共培養(yǎng)，進(jìn)而引起了共培養(yǎng)細(xì)胞H

10、UVEC的遷移功能變化。這結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了外泌體引起的靶細(xì)胞功能改變與外泌體內(nèi)VASN的含量密切相關(guān)，VASN很有可能是一個(gè)重要的細(xì)胞因子，通過(guò)外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)，在腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間傳遞信息，發(fā)揮其生物學(xué)功能。
　　第二部分:miR-152靶向ADAM17抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。
　　ADAM17是ADAM家族成員之一，它能夠作為金屬蛋白酶激活腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha

11、，TNF-α）脫落分泌，同樣也是VASN的重要調(diào)控分子。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，ADAM17將膜型VASN的胞外區(qū)剪切脫落后，胞外區(qū)分泌至血液循環(huán)中作為分泌型VASN發(fā)揮生物學(xué)功能。近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲與miRNAs之間具有密切聯(lián)系，miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)降解、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)、血管形成等相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控腫瘤發(fā)展的作用。因此

12、，我們研究了miRNAs對(duì)ADAM17的調(diào)控機(jī)制。
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提示，ADAM17可能是miR-152的靶基因之一，我們構(gòu)建了包含及缺失miR-152靶位點(diǎn)的ADAM17的3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-152 mmics能結(jié)合并下調(diào)含有其結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因的熒光素酶活性，而對(duì)突變體沒(méi)有影響。過(guò)表達(dá)miR-152對(duì)ADAM17mRNA水平及蛋白水平均有負(fù)調(diào)節(jié)作用。在低氧狀態(tài)下，mi