Bit1在食管鱗癌上皮間質(zhì)轉化中的作用及機制初探.pdf

1、背景與目的：
　　食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是具有中國特色的高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及到多個信號途徑的改變，包括一些抗凋亡因子功能的激活或者凋亡因子功能的抑制。Bit1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)于2004年發(fā)現(xiàn)，有研究認為 Bit1定位在線粒體發(fā)揮促凋亡作用，細胞在受到失黏附刺激時， Bit1蛋白會轉移釋放到胞漿內(nèi)并與其

2、中的AES(amino-terminalenhancer of split)蛋白作用形成復合物，抑制Bcl-2的轉錄從而參與細胞的失巢凋亡。也有報道認為Bit1蛋白富集在高爾基體，活化MAPK信號途徑發(fā)揮抗凋亡作用。Bit1和腫瘤關系的相關研究甚少，并且觀點也不一致，而其在ESCC中的作用，除了本課題組的研究外鮮有報道。
　　研究表明上皮間質(zhì)轉化與腫瘤的侵襲轉移有著密切的聯(lián)系。上皮間質(zhì)轉化（Epithelial-Mesenchym

3、al Transition，EMT）即上皮細胞轉化為具有活性的間充質(zhì)細胞，該過程主要特征是上皮標志蛋白表達降低而間質(zhì)標志蛋白表達升高、上皮細胞極性缺失、細胞與基底膜間的連接溶解及細胞運動增強等，從而使得細胞的侵襲轉移、抗凋亡能力增強。因此，EMT是惡性腫瘤細胞增強侵襲與遷移能力從而發(fā)生轉移的關鍵生物學過程。
　　本課題組前期研究表明，Bit1在ESCC中表達升高且和淋巴結轉移密切相關，下調(diào)ESCC細胞中Bit1表達后可抑制ESCC

4、細胞的增殖、侵襲和遷移能力，但具體機制不清，為了進一步探討B(tài)it1和ESCC侵襲轉移的關系及其分子機制，本實驗通過（1）ESCC細胞中Bit1表達水平的變化與EMT相關蛋白水平表達的關系研究；（2）具有高侵襲能力ESCC細胞亞系的篩選及其形態(tài)、生物學行為變化的檢測；（3）Bit1在轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）誘導ESCC細胞發(fā)生 EMT中的作用研究；（4）初步驗證前期基因

5、芯片所篩選的Bit1下游效應分子等四個部分來研究Bit1在食管鱗癌細胞發(fā)生EMT中的作用及其分子機制，以期可以為 Bit1過表達可促進食管鱗癌侵襲轉移提供佐證，同時也可為發(fā)現(xiàn)ECSS臨床轉移及其預后評價的分子標志物提供新思路。
　　方法：
　　1.siRNA轉染EC9706細胞與EC1細胞下調(diào)Bit1的表達，western blot檢測Bit1、Bcl-2、Bax、CDK4、Snail、E-cadherin、N-cadher

6、in蛋白表達水平的變化。
　　2.通過三次Transwell實驗篩選具有侵襲力強的細胞亞系 EC9706-I3并與親本細胞EC9706-I0進行形態(tài)學、生物學行為的比較。
　　2.1.形態(tài)觀察EC9706-I3細胞并與其親本細胞EC9706-I0進行比較。
　　2.2.CCK-8檢測兩種細胞的增殖能力。
　　2.3.劃痕實驗比較二者的遷移能力。
　　2.4.流式細胞術檢測二者細胞周期的不同。
　　2.

7、5.Western blot檢測二者Bit1、Snail、N-cadherin蛋白水平的變化。
　　3.TGF-β1誘導EC9706細胞建立上皮間質(zhì)轉化模型并檢測Bit1在其中的作用。
　　3.1.形態(tài)觀察TGF-β1不同濃度梯度（0、5、10、15、20、25ng/ml）作用下EC9706細胞形態(tài)變化。
　　3.2.Western blot檢測TGF-β1不同濃度梯度誘導下Bit1、Snail、N-cadherin蛋

8、白表達的變化從而確定TGF-β1的最佳誘導濃度。
　　3.3.以最佳濃度誘導EC9706發(fā)生EMT后siRNA下調(diào)Bit1的表達，觀察細胞形態(tài)的變化。
　　3.4.TGF-β1誘導EC9706發(fā)生EMT后下調(diào)Bit1的表達，western blot檢測Bit1、Snail、N-cadherin蛋白水平的變化。
　　4.Western blot初步驗證前期基因芯片所篩選的Bit1下游效應分子（Paxillin、FAK）。

9、
　　4.1.Western blot檢測EC9706-I0與EC9706-I3細胞中Paxillin、p-Paxillin、FAK、p-FAK蛋白表達的變化。
　　4.2.Western blot檢測不同濃度TGF-β1誘導下EC9706細胞中Paxillin、FAK、p-FAK蛋白表達的變化。
　　4.3.以最佳濃度誘導EC9706細胞后siRNA下調(diào)Bit1表達，western blot檢測Paxillin、FA

10、K、p-FAK蛋白表達水平的變化。
　　結果：
　　1.Bit1-siRNA可下調(diào)EC9706與EC1細胞中Bit1的表達，干擾效率可達66％；其中E-cadherin、Bax、CDK4的表達隨著Bit1的降低而升高，而Bcl-2、Snail、N-cadherin的表達隨著Bit1的下調(diào)而下調(diào)（均P<0.05）。
　　2.三次Transwell實驗篩選之后EC9706-I3細胞亞系與其親本細胞EC9706-I0相比：（

11、1）EC9706-I3形態(tài)變長、有偽足、細胞之間疏散；（2）EC9706-I3在24h、48h、72h的增殖能力均強于其親本細胞EC9706-I0（P<0.001）；（3）EC9706-I3的遷移能力強于其親本細胞EC9706-I0（P<0.05）；（4）EC9706-I3細胞的S期（ DNA合成期）相對于親本細胞有所延長并且 EC9706-I3的增殖指數(shù)較大（P<0.05）；（5）EC9706-I3細胞中Bit1的表達量明顯升高且和N

12、-cadherin、Snail的表達呈正相關（均P<0.05）。
　　3.TGF-β1誘導EC9706細胞建立上皮間質(zhì)轉化模型并檢測Bit1在其中的作用：（1）TGF-β1濃度為5-15ng/ml之間細胞形態(tài)變長，以10ng/ml時最為顯著，20-25ng/ml時細胞形態(tài)逐漸接近正常形態(tài)；（2）Western blot結果顯示TGF-β1為10ng/ml時Bit1、Snail、E-cadherin蛋白的表達量最高（均P<0.05）

13、；（3）10ng/ml TGF-β1誘導EC9706發(fā)生EMT之后再用Bit1-siRNA下調(diào)Bit1的表達后，細胞形態(tài)逐漸變圓，脫落較多；（4）EC9706發(fā)生EMT之后下調(diào)Bit1的表達， N-cadherin、Snail蛋白的表達與Bit1呈正相關（均P<0.05）。
　　4.Western blot初步驗證前期基因芯片所篩選的Bit1下游效應分子（Paxillin、FAK）：（1）Western blot結果顯示EC970

14、6-I0與EC9706-I3細胞中Paxillin、p-Paxillin、FAK、p-FAK蛋白的表達均與 Bit1的表達正相關（均 P<0.05）；（2）TGF-β1誘導濃度為10ng/ml時，EC9706細胞中Paxillin、FAK、p-FAK蛋白的表達量最高且與Bit1表達呈正相關關系（均P<0.05）；（4）TGF-β1誘導之后下調(diào)Bit1的表達，Paxillin、FAK、p-FAK的表達也隨之下降且與Bit1表達呈正相關關系