circAMOTL1在前列腺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，預后較差，且容易復發(fā)，對男性健康構(gòu)成嚴重威脅。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類新型非編碼 RNA，大量存在于真核細胞中，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，高度保守，具有一定的組織和細胞特異性。相關(guān)研究表明circRNA與多種疾病有關(guān)，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。但是關(guān)于circRNA在前列腺癌中作用機制的研究尚無報道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Ep

2、ithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是上皮樣細胞向間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變的過程，它在腫瘤的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，但是其相關(guān)作用機制尚未研究清楚。CircRNA在EMT調(diào)控過程中的作用機制亦不清楚。本研究旨在闡明circAMOTL1在前列腺癌中的作用及其在EMT調(diào)控過程中的作用機制，為后續(xù)研究提供實驗基礎(chǔ)。通過對前列腺癌及前列腺增生組織中circRNA的篩選，發(fā)現(xiàn)circAMOTL1在前列腺癌

3、組織中表達下調(diào)；細胞實驗顯示，circAMOTL1可以調(diào)節(jié)EMT標志基因的表達。本研究將對circAMOTL1在前列腺癌中的表達及其在EMT調(diào)控過程中的作用機制進行研究，為circRNA在前列腺癌診治中的應用提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　闡明circAMOTL1在前列腺癌中的表達及其在EMT調(diào)控過程中的作用機制。
　　方法：
　　1收取PCa及前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia

4、, BPH)臨床標本，分別提取組織的RNA，及病理切片進行形態(tài)學分析。
　　2設計環(huán)狀RNA連接處的divergent primers和convergent primers并進行PCR擴增，檢測circRNAs在前列腺組織及細胞中的表達，并對表達明顯的circRNA進行全長擴增并測序確定序列信息。同時使用circAMOTL1連接處的熒光探針對PCa組織及BPH組織進行熒光原位雜交，檢測circAMOTL1的表達差異。
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5、利用正常前列腺上皮細胞RWPE-1細胞和前列腺癌細胞PC3細胞、LNCaP細胞、DU145細胞的RNA進行實時定量 PCR，用以檢測circAMOTL1在前列腺非癌細胞和癌細胞中的表達差異。細胞分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-circAMOTL1和GFP-Ctl，檢測兩組circAMOTL1的表達。隨后進行Transwell實驗和創(chuàng)傷愈合實驗，檢測GFP-circAMOTL1對細胞遷移和侵襲的影響。
　　4細胞分別轉(zhuǎn)染si-Ctl、si-ci

6、rcAMOTL1和 si-linear AMOTL1，檢測circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的表達。之后再進行Transwell實驗和創(chuàng)傷愈合實驗來檢測si-circAMOTL1對細胞遷移和侵襲的影響。
　　5 PC3細胞過表達或敲低circAMOTL1，然后在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，同時進行Western blot實驗來檢測EMT標志基因的表達。
　　結(jié)果：
　　1檢測環(huán)狀RNA在PCa組織中的表達。

7、>　　通過RT-PCR，在cDNA組能檢測到條帶而gDNA（基因組DNA）組檢測不到條帶表明該環(huán)狀RNA存在，并且能被擴增出來。PCR結(jié)果顯示，circAMOTL1表達最明顯。隨后對circAMOTL1的全長進行擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳及桑格測序進行鑒定，結(jié)果顯示，circAMOTL1全長有1072個堿基，連接處序列與預測的序列一致。
　　2 CircAMOTL1在前列腺癌組織的表達下調(diào)。
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與B

8、PH組織相比，circAMOTL1在PCa組織中的表達水平顯著降低。熒光原位雜交結(jié)果顯示，circAMOTL1探針的熒光強度在PCa組織中顯著低于BPH組織，表明circAMOTL1在PCa組織中表達下調(diào)。
　　3 CircAMOTL1過表達能夠抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲。
　　在正常及不同的前列腺癌細胞株中檢測 circAMOTL1的表達， qRT-PCR結(jié)果顯示，前列腺癌PC3細胞中的circAMOTL1表達水平明顯低

9、于正常前列腺上皮細胞及其它癌細胞。為了研究circAMOTL1的功能，構(gòu)建了 circAMOTL1過表達質(zhì)粒。在 PC3細胞中分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-circAMOTL1和GFP-Ctl，提取RNA并進行實時定量PCR。結(jié)果顯示，過表達組的circAMOTL1表達水平顯著高于對照組。該結(jié)果說明質(zhì)粒能夠成功在PC3細胞中過表達circAMOTL1。過表達circAMOTL1后并進行Transwell實驗，結(jié)果顯示，與對照組相比，circAMO

10、TL1過表達組的細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少。創(chuàng)傷愈合實驗結(jié)果顯示，過表達circAMOTL1能夠明顯降低 PC3細胞的遷移能力。上述結(jié)果說明過表達circAMOTL1能夠抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲。
　　4敲低circAMOTL1能夠促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。
　　PC3細胞分別轉(zhuǎn)染si-Ctl、si-circAMOTL1和si-linear AMOTL1后，提取細胞RNA并反轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR檢測circAMOTL

11、1和AMOTL1 mRNA的表達。結(jié)果顯示，si-linear AMOTL1能降低 circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的水平，而si-circAMOTL1只能降低circAMOTL1的表達。該結(jié)果表明si-circAMOTL1能特異敲低circAMOTL1，而不影響線性AMOTL1的表達。Transwell實驗結(jié)果顯示，circAMOTL1敲低組的細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯高于對照組。創(chuàng)傷愈合實驗結(jié)果顯示，敲低組的細胞遷移能力比對

12、照組強。上述結(jié)果說明敲低 circAMOTL1能夠促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。
　　5 CircAMOTL1參與調(diào)控EMT。
　　普通光學顯微鏡觀察結(jié)果顯示，circAMOTL1過表達后細胞表現(xiàn)為上皮樣細胞形態(tài)，而敲低 circAMOTL1后細胞表現(xiàn)為間質(zhì)樣細胞形態(tài)。Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達circAMOTL1顯著上調(diào)上皮細胞標志蛋白 E-cadherin和 Claudin1的表達，而下調(diào)

13、間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin的表達。相反，敲低circAMOTL1后上皮細胞標志蛋白E-cadherin和Claudin1表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin表達上調(diào)。而兩組的β-catenin的表達水平均無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1 CircAMOTL1存在于前列腺組織中，并在癌變過程中表達下調(diào)。
　　2過表達circAMOTL1抑制而敲低circAMOTL1促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。
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