長鏈非編碼RNA URHC在肝癌細胞增殖與凋亡中的作用及機制研究.pdf

1、【背景】
　　肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,肝癌)是成人肝臟惡性腫瘤中最常見的疾病,雖然肝癌的治療技術不斷提升,如手術切除、肝移植、放化療,但肝癌患者總體5年生存率至今仍未明顯改善。肝癌病死率高、預后差的重要原因之一就是肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制目前仍然知之甚少。然而,隨著現(xiàn)代細胞分子生物學的進展,現(xiàn)已證明肝癌的形成多伴隨一系列分子及信號通路的異常。因此,從分子水平探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機制,并將特征

2、性分子作為抗腫瘤靶點,可為臨床預防和治療肝癌開辟新的途徑。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding,lncRNA)是近年來研究的熱點,它是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,無或很少具有蛋白質編碼功能,曾被認為基因轉錄的“暗物質”,但目前發(fā)現(xiàn)lncRNA具有重要的生物學功能,如調控細胞增殖、細胞周期、細胞分化、細胞凋亡等。除此之外,lncRNA的異常表達與人類疾病密切相關,尤其在腫瘤方面?，F(xiàn)已在乳腺癌、胃癌、肺

3、癌、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNA異常表達,且這些lncRNA主要參與腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤、轉移及復發(fā)等過程,提示lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到癌基因或抑癌基因的作用。
　　與既往研究較多的microRNA(miRNA)相比,lncRNA仍然屬于一個相對未知領域。目前,lncRNA在肝癌中的研究仍較少,即使發(fā)現(xiàn)了幾種與肝癌相關的lncRNA,但仍只是冰山一角,且部分lncRNA具體功能不清,絕大數(shù)lncRNA分

4、子調控機制不明確,因此仍有必要繼續(xù)尋找與肝癌相關異常表達的lncRNA,并探索其功能,進一步挖掘其分子生物學機制,從而更加完善肝癌的分子基礎研究。
　　本課題應用lncRNA芯片檢測正常肝細胞及肝癌細胞系中l(wèi)ncRNA表達譜的差異,初步篩選出與肝癌相關的lncRNA,并進一步探討lncRNA在肝癌中的作用及機制,為將來深入研究lncRNA打下基礎。
　　【目的】
　　利用基因芯片技術篩選差異表達的lncRNA并確定一個

5、新的lncRNA,命名為URHC(up-regulated in hepatocellular carcinoma),探討URHC在肝癌細胞中的生物學功能及其分子調控機制,進而從新的角度闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的機制,為日后臨床分子治療肝癌提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1、利用lncRNA表達譜芯片檢測并比較HepG2、SMMC7721、Huh7等3種肝癌細胞系與正常肝細胞系HL-7702的lncRNA表達情況,從表達水平、ln

6、cRNA長度、數(shù)據(jù)庫完整lncRNA序列、GO富集及KEGG pathway分析等方面篩選與肝癌相關的差異表達的lncRNA,利用實時定量 PCR(qRT-PCR)在肝癌細胞系和組織中驗證部分差異表達的lncRNA,最后確定URHC為后續(xù)研究對象。
　　2、收集52例行肝癌切除術患者的肝癌組織和對應的癌旁組織,采用qRT-PCR方法檢測URHC表達,并分析URHC表達與患者臨床病理特征及預后的關系。
　　3、URHC的體外功

7、能研究:選用高水平表達URHC的肝癌細胞系SMMC7721作為研究對象,轉染URHC特異性siRNA抑制URHC表達水平,體外分別利用MTT、EdU、細胞周期、平板克隆形成、細胞凋亡、Western-blot、Transwell等實驗觀察其對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲及轉移等生物學行為的影響。
　　4、URHC靶基因的預測、驗證及功能研究:結合基因定位分析和生物信息預測,推測ZAK可能是URHC的潛在靶點之一;qRT-PCR檢測ZA

8、K在肝癌組織中的表達情況,并利用 qRT-PCR和Western-blot驗證 URHC與 ZAK之間的表達關系;SMMC7721細胞分別轉染 URHC-siRNA、ZAK-siRNA、共轉染 ZAK-siRNA與URHC-siRNA,利用MTT、細胞周期及Western-blot等方法探索URHC是否通過ZAK發(fā)揮作用。
　　5、URHC調控的分子機制研究:利用 Western-blot檢測 MAPK通路重要蛋白的活化水平,并利

9、用蛋白磷酸酶抑制劑 PD98059和功能實驗對 ERK/MAPK通路進行驗證。
　　【結果】
　　1、與正常肝細胞相比,我們選取在3種肝癌細胞系中同時高或低水平表達且2倍以上變化的lncRNA,認為其差異表達有意義。采用聚類分析,發(fā)現(xiàn)總共有1658個lncRNA差異表達,占所有l(wèi)ncRNA的3.9％,其中2倍以上共有477個lncRNA同時上調,2倍以上共有1181個lncRNA同時下調;5倍以上同時上調56個,5倍以上同時

10、下調131個。這些差異表達的lncRNA與細胞代謝、細胞凋亡、細胞周期等相關基因有關,部分還可能參與MAPK、JAK-STAT、Wnt等信號通路調節(jié)。
　　2、通過基因芯片和組織篩選,我們發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA URHC,其在3種肝癌細胞系中均高表達,經(jīng)qRT-PCR驗證,lncRNA URHC在肝癌細胞和肝癌組織中同時上調表達,符合基因芯片結果。URHC在57.7%(30/52)的肝癌組織中高表達,URHC表達與腫瘤的體積(

11、χ2=8.868,P=0.003)與腫瘤數(shù)目(χ2=6.857,P=0.009)顯著相關,而與年齡、性別、AFP水平、腫瘤轉移、門靜脈癌栓、組織分化及AJCC分期等特征無明顯相關(P>0.05),Kaplan-Meier分析示URHC高表達與患者低生存率有關(χ2=4.863,P=0.027)。
　　3、qRT-PCR結果示 siRNA干擾后URHC表達下調;MTT、EdU結果表明較對照組,下調URHC表達顯著降低細胞增殖能力;細

12、胞周期結果表明URHC表達抑制后G0/G1期細胞顯著增多,而S期細胞顯著降低;平板克隆形成實驗表明,抑制URHC表達后細胞克隆形成數(shù)目較對照組顯著減少;流式細胞術顯示抑制URHC表達后細胞凋亡率顯著高于對照組;Western-blot示 URHC表達下調顯著增加了促凋亡蛋白Bax的表達,提高Bax/Bcl-2之間的比例;除此之外,URHC表達下調后,cleaved caspase3蛋白表達上調,且cleaved caspase3/cas

13、pase3比例顯著升高,以上表明下調URHC表達能有效抑制肝癌細胞增殖并促進凋亡;Transwell實驗表明抑制URHC表達對細胞的侵襲及遷移能力沒有影響。
　　4、基因定位分析發(fā)現(xiàn)ZAK位于URHC基因附近,提示URHC可能以cis-acting作用方式調控其表達;qRT-PCR發(fā)現(xiàn)ZAK在肝癌組織中顯著低表達,且肝癌組織中URHC與ZAK表達呈負相關,URHC表達抑制后ZAK在mRNA水平和蛋白水平均表達上調,提示ZAK可能是

14、URHC作用的潛在靶基因,且URHC通過負調控ZAK表達發(fā)揮作用。MTT示干涉 URHC表達抑制肝癌細胞增殖的能力可以部分被下調ZAK表達所削弱;細胞周期結果表明ZAK下調減少了URHC下調所致G0/G1期細胞量的增加水平。Western-blot示ZAK表達下調降低了Bax蛋白及cleaved caspase3蛋白水平,表明ZAK下調與凋亡抑制有關,且抑制ZAK表達可部分逆轉URHC抑制所介導的細胞凋亡能力。以上表明,URHC通過抑制

15、ZAK表達促進細胞增殖及抑制細胞凋亡。
　　5、Western-blot示URHC表達下調后ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平顯著上調,而ZAK與URHC表達同時抑制減弱了ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平,但高于單純ZAK表達抑制,說明下調URHC表達可促進ZAK表達并激活MAPK通路。后續(xù)的細胞功能實驗表明PD98059能部分逆轉URHC下調所致的抑制細胞增殖作用,且削弱了URHC下調介導的促細胞凋亡能力。以上結果

16、說明URHC發(fā)揮促增殖、抑凋亡是通過抑制ZAK表達,并失活下游ERK/MAPK通路來實現(xiàn)的。
　　【結論】
　　1、我們發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個新的lncRNA URHC,其在肝癌細胞及肝癌組織中均高表達,URHC的表達與肝癌患者的病理特征相關,且可預測肝癌患者預后。
　　2、下調URHC表達抑制肝癌細胞增殖并促進凋亡,但對肝癌細胞侵襲及遷移無明顯影響,提示URHC可能主要通過促進腫瘤的惡性生長發(fā)揮作用。
　　3、URH