結(jié)核分枝桿菌潛伏感染新型候選標(biāo)志物的篩選及目的蛋白的克隆、表達(dá)與純化.pdf_第1頁(yè)
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1、目的：篩選結(jié)核分枝桿菌潛伏感染新型候選標(biāo)志物，建立蛋白質(zhì)體外克隆、表達(dá)及純化的方法。
　　方法：收集2011年至2015年就診于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的涂陽(yáng)患者、其他肺部疾病患者、潛伏感染以及正常人血清，將前期工作中雙向凝膠電泳（2-DE）western blot和質(zhì)譜分析篩選出的特異性蛋白與結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片技術(shù)初步篩選出的與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)的特異性蛋白相結(jié)合，制作成蛋白小芯片，通過(guò)人血清進(jìn)行臨床驗(yàn)證，進(jìn)一步確定候選標(biāo)志物

2、。通過(guò)設(shè)計(jì)所篩選的候選標(biāo)志物 Rv0494基因引物， PCR擴(kuò)增Rv0494基因，構(gòu)建pET28a-Rv0494重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)體外表達(dá)Rv0494蛋白，利用鎳樹(shù)脂對(duì)體外表達(dá)的Rv0494蛋白進(jìn)行純化。
　　結(jié)果：初步篩選出100個(gè)特異性蛋白，制作成小芯片，進(jìn)一步臨床驗(yàn)證明確8個(gè)與潛伏感染相關(guān)的候選生物標(biāo)志物組合，分別是Rv0494、Rv3301c、Rv1860、Rv1821、Rv0280、Rv

3、0351、Rv2031c和Rv1441c，診斷特異度為90.9％，靈敏度為83.1%，其中Rv0494(針對(duì)IgG)和Rv1441c(針對(duì)IgM)表現(xiàn)出較好的特異性。相關(guān)結(jié)果申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利1項(xiàng)（申請(qǐng)?zhí)?01610089096.2）。體外表達(dá)Rv0494蛋白，鎳樹(shù)脂純化獲得單一表達(dá)的Rv0494蛋白。
　　結(jié)論：通過(guò)雙向凝膠電泳（2-DE）western blot、質(zhì)譜分析及結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片技術(shù)成功篩選并初步臨床驗(yàn)證明確8個(gè)

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