S-Equol調(diào)控Txnip表達(dá)對(duì)高糖培養(yǎng)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病(diabetic mellitus，DM)是最常見(jiàn)的慢性代謝性疾病之一，嚴(yán)重危害著人類(lèi)身體健康，給個(gè)人及家庭帶來(lái)極重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。并且DM發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今仍未完全闡明。目前認(rèn)為胰島素抵抗和胰島素分泌功能缺陷是DM發(fā)病的兩大主要因素，已成為糖尿病防治的重要靶點(diǎn)。然而，臨床上針對(duì)其使用的藥物大都存在諸多不良反應(yīng)。因此，不斷尋找和開(kāi)辟糖尿病防治的新途徑已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)，尤其是經(jīng)過(guò)膳食途徑改善糖尿病及其并發(fā)癥具有非常重

2、要的意義。雌馬酚(equol，Eq)是由大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次生代謝物大豆異黃酮(soy isoflavones，SI)經(jīng)微生物代謝形成的重要產(chǎn)物，包括S、R兩種異構(gòu)體，而在動(dòng)物體內(nèi)均為S型[1]。大量研究表明，SI干預(yù)可增加胰島素分泌，促進(jìn)葡萄糖攝取和利用，從而有效控制血糖濃度，改善糖尿病癥狀。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SI的生物學(xué)活性主要由Eq來(lái)實(shí)現(xiàn)[2，3]。Eq具有比SI更高的生物活性和生物利用度，能夠有效的發(fā)揮雌激素樣、抗炎和抗氧化等

3、作用，不僅在骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合癥以及心血管疾病等方面表現(xiàn)出較好的防治效果，而且對(duì)乳腺癌及前列腺癌也具有很好的預(yù)防作用[4]。已有研究表明，Eq可顯著增加葡萄糖耐量[5]，促進(jìn)葡萄糖攝取和利用，提高胰島素敏感性[6]，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，Txnip)在調(diào)控胰島素分泌中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。糖尿病發(fā)病過(guò)程中，胰島素敏

4、感性改變、高血糖、糖皮質(zhì)激素變化和β細(xì)胞凋亡均可誘導(dǎo)Txnip表達(dá)，抑制葡萄糖攝取與利用。Txnip的表達(dá)受多條細(xì)胞外葡萄糖調(diào)控路徑影響，其中碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbohydrateresponse element binding protein，ChREBP）和Max樣蛋白(Max-like protein X，MLx)是調(diào)節(jié)Txnip表達(dá)的最主要轉(zhuǎn)錄因子。高糖可促進(jìn)ChREBP去磷酸化，形成活化的ChREBP。當(dāng)活化Ch

5、REBP進(jìn)入細(xì)胞核，與異質(zhì)二聚體伴侶MLX，Txnip募集的輔助劑和組蛋白乙酰化P300結(jié)合，導(dǎo)致組蛋白H4乙酰化，從而進(jìn)行染色質(zhì)修飾，同時(shí)促使RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)轉(zhuǎn)移到啟動(dòng)子區(qū)，致使Txnip基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄[7]。那么，S-Eq是否能夠通過(guò)ChREBP-Txnip信號(hào)通路調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞分泌功能，從而實(shí)現(xiàn)其抗DM的作用，相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　本課題采用體外培養(yǎng)大鼠胰島素瘤(INS-1)細(xì)胞株，利用高糖刺激建立體外胰島細(xì)胞損傷模

6、型，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，ELISA法測(cè)定葡萄糖刺激胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)功能，TUNEL法聯(lián)合AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Realtime PCR檢測(cè)前胰島素原(preproinsulin，PPI)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporter2，Glut2)、線粒體陰離子載體解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling p

7、rotein2，UCP2) mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)Glut2及UCP2蛋白表達(dá)，以探討S-Eq對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響。并在此基礎(chǔ)上，采用PKA及PP2A試劑盒分別檢測(cè)PKA及PP2A活性，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA和Western blot檢測(cè)ChREBP、Txnip蛋白表達(dá)，結(jié)合Chip及雙熒光素酶報(bào)告基因等技術(shù)深入研究ChREBP-Txnip信號(hào)通路在S-Eq調(diào)控胰島細(xì)胞分泌功能中的作用。
　　本

8、實(shí)驗(yàn)的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)S-Eq可顯著增加高糖培養(yǎng)條件下INS-1細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。
　　(2)S-Eq可顯著上調(diào)高糖培養(yǎng)條件下INS-1細(xì)胞PPI mRNA表達(dá)水平，改善高糖培養(yǎng)條件下INS-1細(xì)胞GSIS功能。同時(shí)可顯著增加高糖處理后細(xì)胞Glut2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而降低UCP2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　(3)S-Eq可顯著降低高糖培養(yǎng)INS-1細(xì)胞內(nèi)PP2A活性，升高P

9、KA活性，抑制INS-1細(xì)胞內(nèi)ChREBP蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　(4)S-Eq可顯著減少ChREBP在ChoRE順式作用元件上募集，下調(diào)ChREBP(wt)轉(zhuǎn)染后INS-1細(xì)胞內(nèi)Txnip啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制Txnip表達(dá)。而在轉(zhuǎn)染ChREBP(dm)質(zhì)粒后，各組INS-1細(xì)胞內(nèi)Txnip啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性均顯著降低。進(jìn)一步采用siRNA沉默ChREBP基因表達(dá)后，ChREBP和Txnip表達(dá)均顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)S-