肝衰竭環(huán)境下清熱解毒涼血化瘀法對骨髓間充質(zhì)干細胞影響的體外實驗研究.pdf

1、研究目的:通過大鼠血清建立干細胞移植治療肝衰竭體外模型，進行骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)。觀測在肝衰竭環(huán)境中間充質(zhì)干細胞的增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)情況，以及在肝衰竭環(huán)境中清熱解毒涼血化瘀法對間充質(zhì)干細胞的影響。進一步從細胞層面探索在肝衰竭環(huán)境中清熱解毒涼血化瘀法與間充質(zhì)干細胞的協(xié)同作用。
　　研究方法:
　　1、大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代篩選:從3-4周齡SPF級SD大鼠骨髓中提取、分離、培養(yǎng)BMSCs。運用全骨髓培養(yǎng)法及傳代篩選法

2、進行細胞培養(yǎng)及純化。當細胞增殖達到80～90％時，進行傳代、擴增。細胞傳代到第3代時用于進一步的檢測及移植。通過細胞形態(tài)學及流式細胞儀鑒定證明實驗所得細胞為BMSCs。
　　2、實驗血清的制備:將30只大鼠分為模型組及健康組，模型組21只大鼠通過腹腔注射D-GalN制造肝衰竭大鼠模型。48h后隨機從模型組和健康組各抽取大鼠3只，采集肝組織進行病理切片，驗證造模成功。再將模型大鼠14只平均分為中藥干預(yù)組和肝衰竭組，中藥干預(yù)組予以肝毒

3、清顆粒灌胃，肝衰竭組和健康組予以等劑量生理鹽水灌胃。3組大鼠灌胃3天后，腹主動脈采血并分離血清，過濾除菌，制備成中藥干預(yù)血清、肝衰竭血清、健康血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　3、建立肝衰竭模擬環(huán)境下骨髓間充質(zhì)細胞培養(yǎng)體系，采集并檢測相關(guān)指標
　　將第3代BMSCs接種于96孔板、6孔板及24孔板中，各設(shè)立3個實驗組，分別加入健康血清、肝衰竭血清、中藥干預(yù)血清進行BMSCs培養(yǎng)。
　　96孔板中培養(yǎng)BMSCs，每組

4、設(shè)3個復孔，分別在培養(yǎng)1d，2d，3d時終止培養(yǎng)，進行CCK-8檢測，使用酶標儀檢測數(shù)據(jù)進行定量分析。觀察BMSCs的增殖存活情況。
　　24孔板中培養(yǎng)BMSCs，每組設(shè)3個復孔，做爬片處理，培養(yǎng)10d后，終止培養(yǎng)，并制作CK18免疫熒光爬片。通過免疫熒光顯微鏡檢測BMSCs肝向分化情況。
　　6孔板中培養(yǎng)BMSCs，每組設(shè)3個復孔，培養(yǎng)10d后，終止培養(yǎng)，提取細胞蛋白，并通過Western blot法檢測甲胎蛋白(AFP)

5、、肝組織白蛋白(ALB)、吲哚胺2，3—雙加氧酶(IDO)，分析BMSCs肝向分化及免疫調(diào)節(jié)活性。
　　研究結(jié)果:
　　1、將BMSCs置于各組血清中培養(yǎng)1天、2天時，CCK-8檢測結(jié)果顯示:健康組、肝衰竭組、中藥干預(yù)組，組間差異無統(tǒng)計學意義;第3天時，CCK-8檢測結(jié)果示:健康組與肝衰竭組，健康組與中藥干預(yù)組的組間差異均有統(tǒng)計學意義，而肝衰竭組與中藥干預(yù)組之間無統(tǒng)計學差異。但在細胞培養(yǎng)10天后觀察發(fā)現(xiàn)，中藥干預(yù)組細胞生長明

6、顯優(yōu)于肝衰竭組。
　　2、BMSCs制作細胞爬片，培養(yǎng)10天后進行CK18免疫熒光檢測。結(jié)果顯示健康組染色為陰性，肝衰竭組及中藥干預(yù)組染色為陽性，后者染色較強，但均明顯弱于肝細胞染色。推測BMSCs肝向分化過程中細胞分化數(shù)量或細胞成熟度較低。
　　3、BMSCs培養(yǎng)10天后通過Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達。ALB蛋白表達結(jié)果顯示:健康組、肝衰竭組、中藥干預(yù)組均有表達，且依次遞增，各組之間有統(tǒng)計學差異，但其表達量

7、較少。AFP蛋白表達結(jié)果顯示:健康組、肝衰竭組、中藥干預(yù)組表達強度依次增強，各組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　4、BMSCs培養(yǎng)10天后通過Western blot法檢測IDO表達，結(jié)果顯示:健康組IDO蛋白無明顯表達。IDO蛋白在中藥干預(yù)組中的表達高于肝衰竭組，且兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)論:
　　通過建立BMSCs移植治療肝衰竭體外模型，觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs在肝衰竭環(huán)境中增殖活性相對下降，具有肝向分化趨勢，及