MiR-608通過靶向調(diào)控MIF基因的表達影響GSCs的生物學(xué)行為.pdf

1、前言：
　　腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是最具侵襲性的顱內(nèi)腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類生命健康。目前臨床治療膠質(zhì)瘤常用的手段是外科手術(shù)切除瘤體后輔以術(shù)后放療。但由于膠質(zhì)瘤的周圍組織浸潤性生長、易復(fù)發(fā)等特點，導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量無法從根本上得到改善，且膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后極差。而膠質(zhì)瘤干細胞(Glioma Stem Cells，GSCs)的自我更新、多向分化等特點使得腦膠質(zhì)瘤容易復(fù)發(fā)，是影響腦膠質(zhì)瘤治療效果的關(guān)鍵因素。
　　MicroRNAs(

2、miRNAs)是一類單鏈非編碼RNAs，分子生物學(xué)研究水平的深入發(fā)展促進越來越多的研究證實miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如在腫瘤的發(fā)生、血管生成、遷移、侵襲中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。有報道表明miR-608在結(jié)腸癌、食管鱗狀細胞癌、非小細胞性肺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，但其在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)作用及機制尚未有明確報道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-608在GSCs中呈低表達，推測miR-608可能在膠質(zhì)瘤中同樣發(fā)揮著抑癌基因的作用，但其發(fā)

3、揮作用的靶位點還需進一步的探討。
　　巨噬細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)作為一種進化上高度保守的多效性分子廣泛過表達于多種腫瘤組織細胞中如結(jié)腸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤母細胞瘤等。MIF具有誘導(dǎo)血管生成、促進細胞周期進程、抑制細胞凋亡的功能。MIF以及MIF受體CD44、CD74廣泛參與并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示MIF在多種腫瘤組織細胞中表達水平較高，如乳

4、腺癌、肝癌、宮頸癌[1-3]。Michel等的研究發(fā)現(xiàn)MIF在腦膠質(zhì)瘤組織及細胞系中高表達，表明MIF在腦膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[4]。生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示MIF是miR-608的潛在結(jié)合位點。但MIF在GSCs中的相關(guān)作用及分子機制還未明確。
　　本研究通過改變miR-608與MIF基因的表達水平，分析GSCs生物學(xué)行為及相關(guān)信號通路蛋白的活性，旨在探討miR-608與MIF在GSCs生物學(xué)行為中的調(diào)控作用

5、，明確其可能的分子作用機制。
　　方法:
　　1、人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87及U251細胞，人胚腎細胞系HEK293T細胞和腦膠質(zhì)瘤干細胞GSCs-U87及GSCs-U251的培養(yǎng)。
　　2、MIF基因過表達或表達沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的構(gòu)建。
　　3、實時熒光定量PCR檢測miR-608和MIF基因在腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達水平。
　　4、Western blot分析腦膠質(zhì)瘤干細胞中MIF蛋白的內(nèi)源性表達水平以及

6、改變miR-608表達水平后腦膠質(zhì)瘤干細胞中MIF蛋白的表達水平。
　　5、雙熒光素酶報告基因分析miR-608和MIF的直接作用。
　　6、MTT實驗檢測改變miR-608表達水平，同時改變miR-608和MIF基因表達水平對腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖能力的影響。
　　7、遷移侵襲實驗分析改變miR-608表達水平，同時改變miR-608和MIF基因表達水平對腦膠質(zhì)瘤干細胞遷移侵襲能力的影響。
　　8、流式細胞儀檢測改

7、變miR-608表達水平，同時改變miR-608和MIF基因表達水平對腦膠質(zhì)瘤干細胞細胞凋亡能力的影響。
　　9、Western blot檢測同時改變腦膠質(zhì)瘤干細胞中miR-608和MIF基因的表達水平時PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、JNK、p-JNK蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立MIF過表達和MIF沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。
　　2、MiR-608在腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達水平顯著下降，

8、MIF基因在腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達水平顯著上升。MiR-608過表達可抑制MIF蛋白的表達水平，miR-608沉默可促進MIF蛋白的表達水平。
　　3、MIF是miR-608的靶基因。
　　4、MiR-608過表達可抑制腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、遷移、侵襲，促進其細胞凋亡。MiR-608沉默可促進腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、遷移、侵襲，抑制其細胞凋亡。
　　5、MiR-608過表達同時MIF沉默可抑制腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、遷移、

9、侵襲，促進其細胞凋亡。MiR-608沉默同時MIF過表達可促進腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、遷移、侵襲，抑制其細胞凋亡。
　　6、MiR-608過表達同時MIF沉默可顯著抑制腦膠質(zhì)瘤干細胞中p-PI3K、p-Akt及p-JNK蛋白活性。MiR-608沉默同時MIF過表達可顯著促進腦膠質(zhì)瘤干細胞中p-PI3K、p-Akt及p-JNK蛋白活性。
　　討論：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-608在GSCs中低表達，通過改變GSCs中mi

10、R-608和MIF的表達水平，檢測其對GSCs生物學(xué)行為及PI3K/Akt、JNK信號通路活性的影響，明確了miR-608通過調(diào)控MIF基因的表達水平調(diào)控GSCs的生物學(xué)行為的可能機制。
　　本研究結(jié)果顯示miR-608在膠質(zhì)瘤干細胞中低表達，表明在膠質(zhì)瘤干細胞中miR-608可能發(fā)揮抑癌基因作用。進一步的研究顯示上調(diào)miR-608的表達水平能抑制膠質(zhì)瘤干細胞的增殖、遷移、侵襲，且促進其細胞凋亡。下調(diào)miR-608的表達水平則有相

11、反的結(jié)果。但是miR-608在GSCs中的具體作用機制尚未明確。生物信息學(xué)軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果表明miR-608與MIF有直接結(jié)合位點且MIF是miR-608的靶基因。表明在GSCs中miR-608通過下調(diào)MIF的表達水平發(fā)揮抑癌基因的作用。MIF作為促癌基因廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)進程。本研究實驗結(jié)果顯示過表達miR-608的同時沉默MIF的表達水平能顯著抑制GSCs細胞增殖、遷移、侵襲，促進GSCs細胞凋亡。而沉默

12、miR-608的同時過表達MIF的表達水平則有與之相反的結(jié)果。從而雙向驗證了miR-608通過下調(diào)MIF的表達水平來發(fā)揮抑癌基因的作用，但其中進一步的作用機制尚不明確。許多研究表明MIF在腫瘤中的作用機制涉及到細胞信號通路的活化。在COS-7/M6細胞、人前列腺癌細胞、人滋養(yǎng)層細胞中，MIF可與CD44和CD74形成復(fù)合物從而激活ERKI/2信號通路，參與調(diào)控細胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示過表達miR-608的同時沉默MIF的表

13、達水平能顯著抑制GSCs細胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-JNK/JNK的表達水平，而沉默miR-608的同時過表達MIF的表達水平則有與之相反的結(jié)果。表明miR-608通過下調(diào)MIF的表達水平抑制PI3K/Akt、JNK信號通路活性。
　　綜上所述，本研究首次揭示了miR-608對GSCs生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用。本研究證明miR-608通過下調(diào)MIF基因的表達水平，抑制PI3K/Akt和JNK通路活性，從而抑制

14、GSCs的增殖、遷移、侵襲，并促進細胞凋亡。因此miR-608可能是腦膠質(zhì)瘤治療的一個新靶點。
　　結(jié)論：
　　1、MiR-608在腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達水平低于在非干細胞中的表達水平。
　　2、MIF是miR-608的靶基因，且miR-608在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控MIF基因的表達。
　　3、過表達miR-608通過靶向結(jié)合MIF并下調(diào)其表達水平，抑制PI3K/Akt及JNK信號通路活性，從而抑制腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖