大豆皂甙Ba抑制棕櫚酸誘導的巨噬細胞炎癥反應活性及其機理研究.pdf

1、慢性非傳染性疾病(NCDs)是當今全球致死的主要原因，給人類健康及社會發(fā)展帶來重大危害，其發(fā)生與生活方式、行為方式、職業(yè)和環(huán)境因素等有關，臨床治療效果并不是很理想，但其發(fā)生在很大程度上是可以預防的。其中炎癥是促進NCDs發(fā)生和發(fā)展的關鍵危害因素。
　　大豆皂甙是大豆及其制品中的一種五環(huán)三萜類植物化學物，近年來大豆皂甙的抗炎活性及其機理備受關注。本課題組前期運用RAW264.7小鼠巨噬細胞體外炎癥模型對五種不同結構的大豆皂甙(SSA

2、1、SSA2、 SS-I、SG-A和SG-B）的抗炎活性研究發(fā)現(xiàn)，SSA1、SSA2和SS-I可呈濃度依賴型的抑制NF-κB活性進而抑制炎癥酶和促炎細胞因子的產(chǎn)生。這些研究表明大豆皂甙可能會通過調(diào)控NF-κB信號通路而發(fā)揮抗炎活性。目前有關大豆皂甙抗炎活性和機理的研究正方興未艾。
　　目的：
　　植物化學物可通過靶向調(diào)控炎癥相關信號通路抑制機體炎癥（尤其是慢性炎癥狀態(tài)）而達到防治NCDs的效果，大豆皂甙因其抗炎等多種活性在N

3、CDs防治方面具有潛在價值。SSBa是一種新提取的B組大豆皂甙單體，其抗炎活性及機制目前國內(nèi)外尚未見報道。因此，本實驗首先以LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞經(jīng)典體外炎癥模型為參照，運用飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)建立模擬體內(nèi)高游離脂肪酸炎癥狀態(tài)的體外巨噬細胞炎癥模型;進一步運用蛋白印跡(WB)、酶聯(lián)吸附免疫(ELISA)、實時熒光定量PCR(FQ-PCR)等技術研究SSBa對炎癥酶和促炎細胞因子產(chǎn)生的影響，并進一步探討其對NF-κB

4、炎性信號通路的調(diào)控作用。旨在弄清SSBa的抗炎活性，初步闡明其抗炎機理，為合理利用大豆皂甙預防慢性炎癥介導的NCDs提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.MTT法測定細胞增殖與毒性
　　25～500μmol/L PA對RAW264.7小鼠巨噬細胞進行不同時間(6、12、24、48、72 h)處理后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后吸棄上清液加入DMSO，酶標儀測定490 nm波長處的吸光度，實

5、驗重復3次。采用SPSS軟件Probit概率單位模型計算細胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　2.Western Blot檢測蛋白表達量
　　細胞培養(yǎng)和處理:①LPS誘導的細胞炎癥模型陽性對照組的建立:0.2～2μg/mL LPS處理6 h;0.1～1μg/mL LPS處理24 h。②PA誘導的細胞炎癥模型的建立:50～250μmol/L PA處理6h或24 h。③SSBa干預PA誘導的細胞炎癥模型:20～200μmol/

6、L SSBa對細胞進行預孵育2h，然后用250μmol/L的PA處理6h或24 h。④NF-κB信號通路相關蛋白(p65/p-p65、IκBα/p-Iκ Bα)的表達檢測:50～250μmol/L PA處理;20～200μmol/L SSBa預孵育2h后250μmol/L的PA處理30 min。收集細胞后提取樣品總蛋白，測定蛋白濃度后用PBS和5×SDSLoading Buffer按所需濃度稀釋樣品蛋白，加熱蛋白變性后進行SDS-PAG

7、E電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育與顯影，得到的蛋白條帶使用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。
　　3.FQ-PCR檢測mRNA表達
　　細胞的培養(yǎng)和處理:①LPS誘導的細胞炎癥模型陽性對照組的建立:0.2～2μg/mL LPS處理6 h;0.1～1μg/mL LPS處理24 h。②PA誘導的細胞炎癥模型的建立:50～250μmol/L PA處理6h或24 h。③SSBa干預PA誘導的細胞炎癥模型:20～200μmol/L

8、 SSBa對細胞進行預孵育2h，然后用250μmol/L的PA處理6h或24 h。收集細胞后用Trizol法提取總RNA，然后對樣品中總RNA的濃度及純度進行測定，通過逆轉(zhuǎn)錄反應將總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，測定cDNA的濃度及純度，使用FQ-PCR試劑盒將cDNA在Real Time PCR儀上擴增出目的基因COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用比較C(t)值的相對定量法，根據(jù)ΔΔC

9、t計算出處理組與對照組之間目標基因的表達差異2-ΔΔCt。
　　4.ELISA測定TNF-α濃度
　　0.2～2μg/mL LPS處理6 h;50～250μmol/L PA處理6 h;20～200μmol/L SSBa預孵育1h，然后用250μmol/L的PA處理6h。設陰性對照組。處理時間結束后收集細胞皿內(nèi)的培養(yǎng)基，離心后使用相應試劑盒進行ELISA測定，結合標準品標準曲線計算檢測樣品中的TNF-α濃度。
　　5.臺

10、盼藍計數(shù)法
　　20～200μmol/L SSBa對細胞進行處理6h或24 h，載玻片上臺盼藍使用液與細胞懸液按1∶1充分混合后，3 min內(nèi)顯微鏡下觀察并計數(shù)藍染和未藍染的細胞，統(tǒng)計每個樣品的相對細胞抑制率和活細胞率，采用SPSS軟件Probit概率單位模型計算細胞增殖半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　6.統(tǒng)計處理
　　結果以均數(shù)±標準差（(X)±SD）表示。采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0分析，運用單因素方差分析進行多個

11、樣本均數(shù)比較，進行分析之前先進行方差齊性檢驗，如果方差齊，運用LSD法進行組間比較;如果方差不齊，運用Dunnett's T3法進行組間比較。采用SPSS19.0軟件Probit Analysis概率單位模型計算細胞增殖半數(shù)抑制濃度。
　　結果：
　　1.PA對RAW264.7小鼠巨噬細胞增殖活力的影響
　　PA對RAW264.7小鼠巨噬細胞的增殖活力呈濃度和時間抑制效應，PA處理RAW264.7小鼠巨噬細胞6、12、

12、24、48和72 h的IC50值分別為610.51、433.42、217.11、167.29和132.20μmol/L。結合WB實驗中炎癥酶的蛋白表達情況，將PA的處理濃度設定為50～250μmol/L，處理的時間設定為6h或24 h。
　　2.SSBa對RAW264.7小鼠巨噬細胞增殖活力的影響
　　SSBa對RAW264.7小鼠巨噬細胞的增殖活力呈濃度和時間抑制效應，SSBa處理RAW264.7小鼠巨噬細胞6h和24 h

13、的IC50值分別為4139.03μmol/L和4020.76μmol/L，表明其毒性較小。本實驗將SSBa的干預濃度設定為20、50、100和200μmol/L，預孵育的時間為1h或2h。
　　3.LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞建立炎癥模型
　　0～2μg/mL的LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞6h或24 h，炎癥酶(COX-2和iNOS)mRNA和蛋白表達水平以及促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6

14、）的mRNA表達水平均呈濃度依賴性顯著升高(P＜0.05)。LPS刺激6h后TNF-α在細胞培養(yǎng)上清中分泌量顯著升高（P＜0.01）。
　　4.PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞建立炎癥模型
　　50～250μmol/L PA處理6h或24 h，可呈濃度依賴性顯著增加炎癥酶(COX-2和iNOS)的mRNA與蛋白表達水平（P＜0.01）、促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的mRNA表達水平(P＜0.05)。P

15、A刺激6h后TNF-α在細胞培養(yǎng)上清中分泌量呈濃度依賴性顯著升高（P＜0.01）。
　　5.SSBa對PA誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞炎癥反應的影響
　　SSBa預孵育可顯著抑制PA引起的炎癥酶（COX-2和iNOS）蛋白與mRNA表達水平以及促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)mRNA表達水平的增高(P＜0.01)。SSBa預孵育可呈濃度依賴性抑制PA刺激的細胞培養(yǎng)上清中TNF-α分泌（P＜0.01）。<

16、br>　　6.SSBa對PA誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞中NF-κB炎性信號通路的影響
　　250μmol/L PA刺激5 min可使p65磷酸化開始增強，到30 min時磷酸化增至表達高峰。不同濃度PA處理30 min，p65總蛋白含量無改變（P＞0.05），但p-p65呈濃度依賴性上升(P＜0.01)。不同濃度SSBa預孵育1h，再用250μmol/LPA刺激30 min，p65總蛋白含量無顯著改變（P＞0.05），10

17、0和200μmol/L SSBa可顯著抑制PA引起的p-p65蛋白表達量增加（P＜0.05）;PA顯著抑制IκBa水平（P＜0.01），20～100μmol/L SSBa可拮抗PA引起的IκBa表達量下降(P＜0.01);PA顯著增高p-IκBa水平（P＜0.01），而50～200μmol/L SSBa可抑制p-IκBa水平（P＜0.01）。
　　結論：
　　1.以炎癥酶（iNOS和COX-2）和促炎細胞因子（TNF-α、I

18、L-1β和IL-6）作為炎癥發(fā)生發(fā)展的指標，PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞可建立與經(jīng)典刺激因子LPS相似的體外炎癥模型。
　　2.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞炎癥模型中，SSBa可抑制炎癥酶(iNOS和COX-2)的mRNA和蛋白表達、促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表達以及抑制TNF-α的分泌。
　　3.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞炎癥模型中，SSBa能抑制IκBα的