梅毒螺旋體鞭毛蛋白免疫活性分析及其誘導HaCaT細胞表達基質金屬蛋白酶的分子機制.pdf

1、背景與目的：梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum,Tp）引起的嚴重危害人類健康的性傳播疾病，其傳播途徑與艾滋病相同，且可明顯增加感染和傳播艾滋病的危險性。近年來梅毒發(fā)病率躍居我國各類性傳播疾病之首，快速準確的診斷對于預防和控制梅毒具有重要意義。迄今為止，Tp的致病機制和致病物質仍不清楚，細菌鞭毛蛋白作為一種經典病原相關分子模式，在促進病原體侵襲和誘導宿主炎癥反應中發(fā)揮重要作用。角質形成細胞是皮膚屏障中重要的免疫前哨細

2、胞，參與皮膚免疫炎癥反應。因此，我們推測：Tp鞭毛蛋白可能通過誘導角質形成細胞表達基質金屬蛋白酶，進而降解細胞外基質，引起皮膚免疫炎癥反應并促進Tp侵襲。本研究旨在通過原核表達重組Tp鞭毛蛋白，分析其免疫原性和免疫反應性，評價其是否具有候選抗原的價值。同時，以人皮膚角質形成細胞為靶細胞，明確Tp鞭毛蛋白能否通過TLR5激活角質形成細胞表達基質金屬蛋白酶，闡明Tp鞭毛蛋白誘導角質形成細胞基質金屬蛋白酶的相關信號通路。本研究將為闡明Tp分子

3、致病機制提供新思路和依據，對梅毒防控具有重要現實意義。
　　方法：
　　1.以Tp Nichols標準株基因組DNA為模板，PCR擴增Tp鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3全基因片段；構建pET28a-FlaB1（FlaB2、FlaB3）原核表達載體；酶切、測序鑒定后，轉化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中。
　　2.IPTG誘導重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3表達，Western B

4、lot對表達產物進行分析和鑒定；用Ni2+-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測定蛋白濃度。
　　3.以Tp Nichols株，Chicago株和Tp臨床分離株（nhgz01和nhgz02）建立梅毒感染動物模型，收集感染兔血清，Western Blot檢測重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3與感染兔血清和梅毒患者血清的免疫反應性。
　　4.重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3免疫新西蘭兔，收集免疫血清

5、，Western Blot和ELISA法檢測重組蛋白的免疫原性和免疫反應性。
　　5.建立重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3 ELISA方法，檢測各期梅毒患者血清、交叉血清及陰性血清中特異性IgG和IgM，初步評價重組蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3在梅毒血清學診斷中的應用價值。
　　6.培養(yǎng)人永生化的角質形成細胞（ HaCaT），以10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3分別刺激HaCaT細胞4

6、8h后，蛋白芯片檢測基質金屬蛋白酶的表達變化。
　　7.以不同濃度0.1、1、10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3分別刺激HaCaT細胞24h后，RT-PCR檢測MMP-9、MMP-13的mRNA表達水平，明膠酶譜實驗和Western Blot檢測MMP-9的活性和表達水平，ELISA法檢測MMP-13的表達水平。
　　8.HaCaT細胞轉染2μg TLR5、TLR2、TLR4、MyD88特異性干擾質粒和對照質

7、粒后培養(yǎng)24h，隨后用10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激培養(yǎng)48h，Western Blot和ELISA分別檢測MMP-9、MMP-13的表達變化。
　　9.分別用終濃度為10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞15min、30min、60min、120min后，Western Blot檢測ERK、JNK、p38磷酸化水平。
　　10.分別用終濃度為10μg/mL的FlaB1、

8、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞15min、30min、60min、120min后，Western Blot檢測細胞中總IκBα的降解水平，磷酸化IκBα的表達水平。用10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞2h后，免疫熒光檢測NF-κB p65亞基核轉位情況。
　　11.采用特異性抑制劑ERK(10μM PD98059)、JNK(20μM SP600125)、p38MAPK(10μM SB20

9、3580)、NF-κB(10μM BAY117082)預處理HaCaT細胞后，用終濃度為10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞48h，Western Blot和ELISA分別檢測MMP-9、MMP-13的表達變化。
　　結果：
　　1.PCR擴增獲得與目的片段大小相符的基因片段：FlaB1（861bp）、FlaB2（861bp）、FlaB3（858bp），重組質粒經測序鑒定與目的基因一致。

10、>　　2.IPTG誘導表達出相對分子量約為36kDa(FlaB1)，35kDa(FlaB2)，34kDa(FlaB3)的目的蛋白，經Ni2+-NTA純化后BCA測定濃度約為2mg/mL。
　　3.在新西蘭兔感染Tp Nichols標準株，Chicago株及Tp臨床分離株(nhgz-01和nhgz-02)后獲取的梅毒感染兔血清，以及梅毒患者血清中均檢測到FlaB1、FlaB2和FlaB3特異性抗體的表達。
　　4.Tp鞭毛蛋白

11、FlaB1、FlaB2、FlaB3在初次免疫后7天，抗血清中即可檢測出鞭毛蛋白的相應IgG抗體，三次免疫后獲取的免疫血清效價達到1:51200。
　　5.各蛋白IgG ELISA總的敏感性分別為：FlaB1（95.4％）、FlaB2（92.6%）和FlaB3（95.1%），在IgM ELISA中，重組蛋白對一期梅毒和先天梅毒表現了較好的敏感性，其敏感性分別為：FlaB1（76.8%，83.1%）、FlaB2（72.0%，87.7%

12、）和FlaB3（74.4%，89.2%）；IgG ELISA總的特異性分別為：FlaB1（98.9%）、FlaB2（95.8%）和FlaB3（95.8%），在IgM ELISA中，其特異性分別為：FlaB1（96.8%）、FlaB2（97.9%）和FlaB3（95.8%）。
　　6.鞭毛蛋白誘導HaCaT表達多種MMPs和TIMP，其中MMP-13，TIMP-1，TIMP-2在三組中表達量均明顯升高；僅FlaB1可誘導MMP-9的

13、表達量顯著升高。
　　7.FlaB1誘導MMP-9 mRNA和蛋白表達呈濃度依賴性，10μg/mL FlaB1可誘導MMP-9 mRNA和蛋白表達水平顯著升高。MMP-13 mRNA和蛋白表達水平也呈濃度依賴性，當蛋白濃度達到10μg/mL時，可引起MMP-13 mRNA和蛋白表達水平顯著升高。
　　8.HaCaT細胞轉染TLR5和MyD88干擾質粒后可顯著抑制MMP-9、MMP-13的表達，而轉染TLR2和TLR4干擾質粒

14、后，MMP-9、MMP-13的表達量無明顯改變。
　　9.FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞后可誘導ERK、JNK、p38發(fā)生不同程度磷酸化且呈一定的時間依賴性。
　　10.FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞后，IκBα發(fā)生不同程度的降解和磷酸化且呈一定的時間依賴性。FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細胞2h后，NF-κB p65亞基發(fā)生了不同程度的核轉位。
　　11.

15、HaCaT細胞采用特異性抑制劑處理后，FlaB1誘導MMP-9的表達量被顯著抑制，但是p38特異性抑制劑SB203580處理細胞后，MMP-13的表達水平與對照組比較，無顯著性差異。
　　結論：
　　1.梅毒螺旋體鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3具有較強免疫活性，能夠誘導機體產生特異性免疫應答，可做為梅毒血清診斷候選抗原。
　　2.梅毒螺旋體鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3經TLR5/MyD88依賴