氧化應激誘導自噬在白癜風發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、背景：白癜風是臨床常見的皮膚黏膜色素脫失性疾病，本病皮損多發(fā)生在曝光部位，重者可造成損容性表現(xiàn)，嚴重影響患者的身心健康。白癜風發(fā)病的具體機制目前尚不清楚，但造成本病發(fā)生的最終環(huán)節(jié)已經證實為患者皮損局部黑素細胞被破壞。新近研究證實，黑素細胞氧化應激狀態(tài)是導致白癜風患者表皮黑素細胞破壞的關鍵因素。黑素細胞在受到內外環(huán)境刺激導致的氧化應激狀態(tài)時，細胞內過量的氧自由基可以干擾細胞的正常生理代謝、增殖和分化，并會進一步誘發(fā)機體針對自身黑素細胞的免

2、疫反應，導致黑素細胞出現(xiàn)不可逆性損傷。既往研究發(fā)現(xiàn)白癜風患者黑素細胞較正常人更易受到氧化應激，但其中的具體機制尚未闡明。因此，明確白癜風患者黑素細胞易受氧化應激的具體機制對于闡明白癜風發(fā)病的具體分子機制、提供針對性的臨床精準治療靶點具有極其重要的意義。
　　細胞自噬是真核生物細胞內降解聚集蛋白、受損細胞器及外源微生物等的一種保守的生物學現(xiàn)象。既往研究指出細胞處于氧化應激時胞內增高的ROS可以通過多種信號途徑激活細胞自噬，保護細胞免

3、受氧化損傷。Nrf2-ARE通路已被證實是黑素細胞在氧化應激時被激活的關鍵抗氧化通路，氧化應激時胞內增高的ROS可促進蛋白Nrf2轉移入核，與細胞內多種II相解毒酶和抗氧化分子基因啟動子區(qū)域的ARE結合，從而轉錄促進其表達以發(fā)揮對抗氧化損傷的作用。新近研究指出：自噬過程中關鍵蛋白p62啟動子區(qū)的同樣有ARE結合位點，Nrf2可入核與p62啟動子區(qū)域ARE結合，上調其表達，從而參與細胞自噬完成。我們課題組既往已經證實白癜風黑素細胞存在Nr

4、f2-ARE通路異常，由此，我們提出如下的假說：氧化應激狀態(tài)下，正常黑素細胞內ROS可通過激活Nrf2-P62通路促進細胞自噬，保護黑素細胞抵抗氧化損傷。而白癜風黑素細胞存在ROS激活Nrf2-P62通路異常，導致細胞自噬水平激活障礙，使白癜風黑素細胞易受氧化損傷。
　　目的：
　　1.明確氧化應激時細胞自噬在正常人黑素細胞抗氧化損傷中的作用；
　　2.分析氧化應激時白癜風黑素細胞自噬水平與正常人黑素細胞間的差異及其作

5、用；
　　3.揭示氧化應激時Nrf2-p62通路對正常黑素細胞及白癜風黑素細胞自噬的調控差異及其機制。
　　方法：
　　1.以不同濃度H2O2處理正常人黑素細胞系PIG1，CCK8法檢測細胞活性，確定最佳的體外黑素細胞氧化應激模型；
　　2.H2O2處理細胞不同時間，以免疫印跡、透射電鏡及激光共聚焦顯微鏡檢測正常人原代黑素細胞、正常人黑素細胞系PIG1、白癜風患者黑素細胞系PIG3V細胞自噬的水平；
　　3

6、.H2O2、自噬抑制劑及自噬促進劑處理細胞后，以流式細胞技術檢測正常人原代黑素細胞、正常人黑素細胞系PIG1、白癜風患者黑素細胞系PIG3V細胞凋亡、線粒體膜電位及胞內ROS的變化情況。
　　4.分別以Nrf2、p62干涉片段或過表達質粒轉染正常人黑素細胞系PIG1及白癜風患者黑素細胞系PIG3V，再予以H2O2處理細胞后，以免疫印跡、Real-time PCR和激光共聚焦顯微鏡檢測細胞自噬水平變化。
　　5.分別以Nrf2

7、干涉片段及p62過表達質粒轉染白癜風患者黑素細胞系PIG3V，再予以H2O2處理細胞后，以流式細胞技術、免疫印跡和激光共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡、線粒體膜電位、胞內ROS及細胞自噬水平變化。
　　結果：
　　1.體外培養(yǎng)的正常人原代黑素細胞及正常人黑素細胞系PIG1在H2O2作用下細胞活性呈濃度依賴性降低，0.5mM H2O2處理細胞24h可建立最佳的體外黑素細胞氧化應激模型；
　　2.H2O2作用細胞一段時間內可呈時間

8、依賴性顯著刺激正常人原代黑素細胞及正常人黑素細胞系PIG1中自噬相關蛋白LC3II/I表達比值升高，細胞自噬溶酶體數(shù)量增多；
　　3.自噬促進劑雷帕霉素預處理正常人原代黑素細胞及正常人黑素細胞系PIG1細胞后，可顯著降低兩種細胞在H2O2作用后的細胞凋亡比例及胞內ROS水平，顯著提高兩種細胞在H2O2作用后的細胞線粒體膜電位水平。自噬抑制劑氯喹預處理正常人原代黑素細胞及正常人黑素細胞系PIG1細胞后，可顯著增高兩種細胞在H2O2作

9、用后的細胞凋亡比例及胞內ROS水平，顯著降低兩種細胞在H2O2作用后的細胞線粒體膜電位水平；
　　4.H2O2作用正常人黑素細胞系PIG1一定時間后，細胞內自噬相關蛋白LC3II/I表達比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著高于H2O2作用白癜風患者黑素細胞系PIG3V后。同時H2O2作用正常人黑素細胞系PIG1一定時間后，細胞凋亡比例及胞內ROS水平顯著低于H2O2作用白癜風患者黑素細胞系PIG3V后，細胞線粒體膜電位水平顯著高于H2O2作用

10、白癜風患者黑素細胞系PIG3V后；
　　5.敲低正常人黑素細胞系PIG1中蛋白Nrf2表達后，H2O2誘導的細胞內自噬相關蛋白LC3II/I表達比值、蛋白p62水平及自噬溶酶體數(shù)量顯著低于轉染空白對照組。敲低正常人黑素細胞系PIG1中蛋白p62表達后，H2O2誘導的細胞內自噬相關蛋白LC3II/I表達比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著低于轉染空白對照組。在敲低蛋白Nrf2的正常人黑素細胞系PIG1中過表達蛋白p62，H2O2誘導的細胞內自噬

11、相關蛋白LC3II/I表達比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著高于單純敲低蛋白Nrf2的正常人黑素細胞系PIG1組；
　　6.以氯喹預處理細胞以抑制胞內蛋白經自噬降解后，H2O2作用細胞不同時間段，正常人黑素細胞系PIG1細胞內蛋白Nrf2及P62的表達顯著高于白癜風患者黑素細胞系PIG3V，正常人黑素細胞系PIG1細胞核內蛋白Nrf2表達顯著高于白癜風患者黑素細胞系PIG3V；
　　7.在白癜風患者黑素細胞系PIG3V中過表達蛋白p6

12、2，H2O2誘導的細胞內自噬相關蛋白LC3II/I比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著高于白癜風患者黑素細胞系PIG3V的轉染空白對照組。在白癜風患者黑素細胞系PIG3V中過表達蛋白p62，H2O2作用后的細胞凋亡比例及胞內ROS水平顯著低于白癜風患者黑素細胞系PIG3V的轉染空白對照組，細胞線粒體膜電位水平顯著高于白癜風患者黑素細胞系PIG3V的轉染空白對照組。
　　結論：通過本研究，我們首次明確了氧化應激可促進正常人黑素細胞中細胞自噬水平