蝎毒多肽提取物通過MICA-NKG2D途徑調控肝臟移植瘤中浸潤自然殺傷細胞活性的機制.pdf

1、目的：
　　自然殺傷(Natural killer,NK)細胞是機體固有免疫系統(tǒng)重要組成部分，在肝臟、肺臟等免疫器官中含量豐富，而且與外周NK細胞相比其免疫表型、功能等表現(xiàn)出器官特異性。在正常情況下，NK細胞表面的活化性受體與靶細胞表面的配體直接結合并通過釋放細胞毒性物質，誘導活化靶細胞凋亡程序，從而發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用。MICA/NKG2D是NK細胞活化的主要信號通路，在NK細胞活化及誘導殺傷靶細胞中發(fā)揮重要作用。然而在腫瘤發(fā)

2、生過程中，腫瘤細胞仍能夠通過多種途徑逃避機體的免疫監(jiān)視功能，研究認為腫瘤細胞抗原異常表達、腫瘤微環(huán)境中細胞因子及其他免疫細胞相互作用等因素所引起的NK細胞活性降低對于誘導腫瘤免疫逃逸的發(fā)生起了重要作用。因此，提高NK細胞活性，增強其對腫瘤細胞的殺傷識別及清除作用被視為抵抗腫瘤免疫逃逸，抑制腫瘤增殖的重要渠道。
　　我們在前期研究發(fā)現(xiàn)：蝎毒多肽提取物（polypeptide extract from scorpion venom，

3、PESV）對多種腫瘤細胞具有抑制作用，并通過抑制腫瘤微血管生成、調節(jié)巨噬細胞和樹突狀細胞抗原提呈，參與對腫瘤細胞的清除，但 PESV對天然免疫細胞尤其是肝臟NK細胞在抗腫瘤中的調節(jié)輔助作用尚未有相關研究，能否改善NK細胞在腫瘤患者及荷瘤小鼠中的免疫抑制效應是我們關注研究的重點。在此基礎上，觀察PESV對于肝癌的相關抑制作用以及腫瘤微環(huán)境中NK細胞的活化的調節(jié)作用機制，為進一步探討PESV調節(jié)機體天然免疫、抗腫瘤活性提供新策略。
　

4、　方法:
　　1.PESV對人肝癌細胞HepG2細胞和正常人外周淋巴細胞PBLs活性的影響：采用MTT法檢測不同濃度PESV對細胞活性的影響；流式細胞術檢測PESV對HepG2細胞周期的影響。
　　2.流式細胞術檢測各藥物干預組對HepG2細胞表面mMICA表達比例。
　　3.LDH細胞毒性檢測法檢測NK細胞對PESV干預組HepG2細胞的殺傷作用：無菌分離正常人外周血 NK細胞作為效應細胞，以不同藥物處理組 HepG

5、2細胞作為靶細胞，按不同效靶比共同培養(yǎng)4h，采用LDH細胞毒性檢測NK細胞殺傷功能。
　　4.采用直接注射法構建 H22肝癌原位移植瘤小鼠模型，術后隨機分為荷瘤對照組（Control），PESV低劑量組（PESV-L，10mg/ml）和PESV高劑量組(PESV-H,40mg/ml)，另選取正常非手術小鼠為正常對照組(Normal)，分別給予PESV和生理鹽水連續(xù)灌胃14天后處死小鼠取肝腫瘤組織測量腫瘤體積和腫瘤質量，計算抑瘤率。

6、另取同樣建模處理小鼠給予14天用藥干預后停藥并觀察其荷瘤生存期。
　　5.采用HE染色觀察肝臟腫瘤組織病理變化。
　　6.采用流式細胞術檢測小鼠肝臟、脾臟中CD3-NK1.1+細胞及其表面NKG2D的表達。
　　7.采用免疫組織化學法檢測肝臟腫瘤組織中NK1.1+細胞的浸潤。
　　8.實時定量PCR法檢測肝臟腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA表達。結果:
　　1.PESV抑制HepG2細胞活性
　　

7、MTT結果顯示：PESV能夠明顯抑制HepG2細胞的活性，抑制作用呈劑量依賴性，而對PBLs細胞活性沒有明顯影響；細胞周期結果顯示PESV能顯著提高G1期HepG2細胞所占比例，使細胞增殖停滯在G1期（P<0.05）。
　　2.PESV顯著提高HepG2細胞表面mMICA的表達，增強NK細胞的殺傷活性
　　流式細胞術結果顯示不同劑量PESV作用細胞24h后HepG2細胞表面mMICA的表達顯著提高（P<0.05），與不同效靶

8、比的 NK細胞共培養(yǎng)后 NK細胞的殺傷活性顯著提高（P<0.05）。采用抗MICA抗體封閉后，NK細胞殺傷活性顯著降低，PESV未見顯著增強作用。
　　3.PESV抑制H22原位移植瘤小鼠腫瘤生長，延長荷瘤生存期
　　PESV大、小劑量組肝臟移植瘤的生長均受到抑制，腫瘤體積和瘤質量均低于荷瘤對照組（P<0.05），腫瘤抑制率分別為30.77％和15.38%。生存期觀察顯示PESV大劑量組能顯著延長荷瘤小鼠生存時間，生命延長率

9、為34.06%（P<0.05）；組織病理學結果顯示荷瘤對照組肝臟腫瘤細胞排列緊密，異型性顯著，呈浸潤性生長，PESV大、小劑量組出現(xiàn)明顯壞死區(qū)，細胞異型性減輕。
　　4.PESV提高荷瘤小鼠肝臟及脾臟NK細胞浸潤，促進其表面活化性受體NKG2D的表達
　　流式細胞術結果顯示，與正常對照組相比，荷瘤對照組小鼠肝臟及脾臟NK細胞所占總淋巴細胞的頻數(shù)顯著降低，NKG2D表達顯著下調（P<0.05），提示NK細胞出現(xiàn)免疫抑制；而PE

10、SV大劑量組小鼠肝臟NK細胞占肝臟總淋巴細胞的比例顯著高于荷瘤對照組（P<0.05），同時脾臟 NK細胞比例也顯著提高（P<0.05），NK細胞表面的活化性受體NKG2D表達在PESV組均顯著增高（P<0.05），有利于NK細胞殺傷活性的提高。免疫組化染色結果顯示，給予 PESV處理后 NK細胞在腫瘤組織中浸潤程度顯著增加（P<0.05），且主要分布在癌旁組織中，腫瘤壞死區(qū)域也可見少量分布。
　　5.PESV提高NK細胞毒性顆粒的

11、表達
　　實時定量PCR結果顯示，PESV大劑量組腫瘤組織中穿孔素和顆粒酶B的mRNA表達量分別是荷瘤對照組的3.62倍和5.82倍（P<0.05），表明PESV能顯著提高腫瘤組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達。
　　結論:
　　1.PESV調節(jié)HepG2細胞周期抑制細胞增殖;
　　2.PESV通過提高腫瘤細胞表面MICA的表達，增強NK細胞對其殺傷活性;
　　3.PESV抑制小鼠肝臟原位移植瘤的生長，