HIV原發(fā)感染者自然殺傷細(xì)胞NKG2A-NKG2C受體變化研究.pdf

1、目的：
　　 獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的一種嚴(yán)重傳染病。人類免疫缺陷病毒(HIV)主要侵犯免疫系統(tǒng)的CD4+T淋巴細(xì)胞,造成機(jī)體免疫功能下降,最終因患各種機(jī)會(huì)性感染或腫瘤而死亡。研究表明,在HIV感染過程中,天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)一方面受到病毒感染的損害

2、,細(xì)胞數(shù)量和功能發(fā)生變化,另一方面依舊發(fā)揮抗病毒的功能,抑制病毒復(fù)制。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)是天然免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)細(xì)胞,在控制腫瘤和微生物感染中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞不需要預(yù)先的致敏作用,就能溶解病毒感染細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子,限制感染并協(xié)助獲得性免疫的應(yīng)答。迄今為止,國(guó)際上關(guān)于NKG2家族受體的報(bào)道主要集中于單一受體表達(dá)的研究,而很少對(duì)兩種不同作用的受體或者多種受體在同

3、一NK細(xì)胞表面表達(dá)進(jìn)行研究,那么NKG2A和NKG2C是否會(huì)同時(shí)表達(dá)在一個(gè)NK細(xì)胞表面,還是只表達(dá)NKG2A不表達(dá)NKG2C或只表達(dá)NKG2C不表達(dá)NKG2A呢?以往此類的研究未見報(bào)道。單獨(dú)研究一種受體只能片面反映NK細(xì)胞的功能,所以只有對(duì)抑制性受體和活化性受體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),才更有利于反映出不同類型NK細(xì)胞在HIV感染后的變化和作用。中國(guó)人群的遺傳特征和HIV流行毒株也與歐美人群不同,因此對(duì)中國(guó)人群NK細(xì)胞表面NKG2A和NKG2C表達(dá)

4、同時(shí)進(jìn)行研究非常重要。此外,HIV慢性感染者NK細(xì)胞表面NKG2A和NKG2C的表達(dá)偶見報(bào)道,那么在原發(fā)感染者中表達(dá)情況又如何呢?而且HIV原發(fā)感染病例很難得到,目前對(duì)HIV原發(fā)感染者研究NK細(xì)胞表面NKG2A和NKG2C的組合表達(dá)國(guó)際上尚無報(bào)道。由于NK細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤和感染的第一道防線,在獲得性免疫應(yīng)答之前就發(fā)揮免疫作用來保護(hù)機(jī)體。在HIV原發(fā)感染階段獲得性免疫還沒有完全建立,主要依靠天然免疫特別是NK細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。因此利用原

5、發(fā)感染隊(duì)列研究NK細(xì)胞表面受體表達(dá)和細(xì)胞功能具有重要的科學(xué)意義。本研究以原發(fā)感染HIV的男男同性戀人群為主,應(yīng)用多色流式細(xì)胞分析技術(shù),對(duì)NK細(xì)胞表面抑制性受體NKG2A和活化性受體NKG2C的表達(dá)進(jìn)行研究。
　　 方法
　　 1、研究對(duì)象
　　 22例HIV原發(fā)感染(primary HIV infection,PHI)者來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診,均為男性,年齡分布為21-53歲(33±10),感染的

6、亞型以CRF01_AE為主,入選標(biāo)準(zhǔn)為滿足以下一項(xiàng)或多項(xiàng)條件:①在6個(gè)月內(nèi)HIV抗體陽轉(zhuǎn)者；②HIV抗體陰性但HIV RNA陽性者；③HIV抗體弱陽性但在兩周之內(nèi)可以重復(fù)并OD值較前次升高者；④有早期HIV感染的臨床癥狀、HIV抗原陽性及WB抗體檢測(cè)少于4條蛋白帶者。23例HIV抗體陰性的健康對(duì)照(HIV-negativenormal control,NC),均為男性,年齡分布為22-60歲(31±8),符合以下標(biāo)準(zhǔn):HIV抗體陰性,血

7、常規(guī)及肝功正常,乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性,無免疫系統(tǒng)疾病。Fiebig分期是早期HIV感染的分期系統(tǒng)[20],我們根據(jù)Fiebig分期系統(tǒng)估計(jì)HIV原發(fā)感染者的感染時(shí)間。
　　 2、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值的檢測(cè)
　　 將20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,逆向加樣法加入50μl混勻的抗凝全血,室溫避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室溫避光15mi

8、n,應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),MultiSET軟件分析結(jié)果,得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值。
　　 3、NK細(xì)胞各亞群NKG2A、NKG2C的檢測(cè)
　　 每人設(shè)計(jì)兩管,一管為同型對(duì)照,一管為染色管,在染色管中加入熒光抗體組合CD3-FITC/CD16-Percp-Cy5.5/CD56-PE-Cy7/NKG2A-PE/NKG2C-APC,再加入100μl混勻的抗凝全血,室溫避光30min。加入自配溶血

9、素3ml,室溫避光8 min,離心,300g,5min,棄上清?；靹?加入3ml鞘液重懸,離心,300g,5min,棄上清。再混勻,加入3ml鞘液重懸,離心,300g,5min,棄上清?；靹蚝蠹尤牒?％多聚甲醛的固定液200μl重懸,應(yīng)用FACSAria流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),BDFACSDivTM軟件分析結(jié)果。
　　 4、HIV病毒載量測(cè)定
　　 以500μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA,采用Roche公司HIV-1

10、Monitor 1.5試劑盒在COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量?jī)x上以RT-PCR方法測(cè)定病毒載量。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示,兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、HIV原發(fā)感染者不同感染時(shí)間NKG2A、NKG2C表達(dá)情況

11、r>　　 我們選取感染時(shí)間6個(gè)月內(nèi)的HIV原發(fā)感染者,根據(jù)感染時(shí)間不同將其分成兩組,分別是感染3個(gè)月組16例和感染6個(gè)月組13例,對(duì)HIV原發(fā)感染者感染3個(gè)月、6個(gè)月時(shí)NK細(xì)胞亞群和受體表達(dá)情況進(jìn)行研究。
　　 (一)NK細(xì)胞亞群構(gòu)成情況
　　 結(jié)果顯示:與HIV抗體陰性健康對(duì)照相比,CD56dimCD16+NK細(xì)胞的百分率在感染3個(gè)月組和感染6個(gè)月組均顯著降低(P=0.014,P=0.040)；CD56-CD16+N

12、K細(xì)胞的百分率在感染3個(gè)月組和感染6個(gè)月組均顯著升高(P=0.001,P=0.001)；CD56briCD16+/-NK細(xì)胞的百分率在感染6個(gè)月組顯著降低(P=0.017)。
　　 (二)NK細(xì)胞各亞群NKG2A、NKG2C的表達(dá)情況
　　 二、HIV原發(fā)感染者NK細(xì)胞表面NKG2A、NKG2C表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　 三、病毒調(diào)定點(diǎn)(set point)不同的HIV原發(fā)感染者NKG2A、NKG2C表達(dá)的變化情況

13、r>　　 四、HIV原發(fā)感染者免疫、病毒等指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　 結(jié)論
　　 1、單獨(dú)分析HIV原發(fā)感染者總NK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá),各組無差異。同時(shí)分析NKG2A、NKG2C的表達(dá),NKG2A+NKG2C-在總NK細(xì)胞和各亞群NK細(xì)胞表面表達(dá)下降,表明同時(shí)檢測(cè)NKG2A、NKG2C以及分析不同NK細(xì)胞亞群,才能真正反映NK細(xì)胞在HIV感染后的變化。
　　 2、與HIV抗體陰性的健康對(duì)照相比,HIV原發(fā)感染

14、者NKG2A+NKG2C-NK細(xì)胞的百分率降低,NKG2C+NK細(xì)胞和NKG2C+NKG2A-NK細(xì)胞的百分率升高,提示NK細(xì)胞接收到的活化信號(hào)增多,活性增強(qiáng),發(fā)揮殺傷作用。
　　 3、HIV原發(fā)感染者低病毒調(diào)定點(diǎn)組NKG2A+NK細(xì)胞、NKG2A+NKG2C-NK細(xì)胞的百分率低,NKG2C+NKG2A-NK細(xì)胞的百分率高,提示NKG2A低表達(dá)NKG2C高表達(dá)使NK細(xì)胞功能活性增強(qiáng),在感染早期抑制病毒復(fù)制,影響病毒調(diào)定點(diǎn)。