干濕實(shí)驗(yàn)結(jié)合預(yù)測(cè)及鑒定轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合靶點(diǎn)和靶基因.pdf

1、繪制基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是功能基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究的核心問題之一。構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)最重要的首先是鑒定基因組編碼的所有轉(zhuǎn)錄因子蛋白以及它們?cè)诨蚪M中全部的DNA結(jié)合靶點(diǎn)（TFBS）及靶基因。目前已經(jīng)在人的基因組鑒定出近3000種轉(zhuǎn)錄因子，而其中能夠和DNA直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子約700多個(gè)。在這些：DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子中，幾乎沒有一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在人基因組中的全部功能性DNA結(jié)合靶點(diǎn)（也稱為結(jié)合譜）及其靶基因得到徹底明確地描述。因此，成為構(gòu)建基

2、因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)面臨的最大障礙。
　　 為了解決這一問題，近年來已經(jīng)發(fā)展了多種高通量預(yù)測(cè)及鑒定TFBS的新技術(shù)，如雙鏈DNA微陣列芯片（dsDNA microarray）（也稱為蛋白結(jié)合微陣列，PBM）、染色體免疫沉淀.芯片（ChIP-chip）、染色體免疫沉淀-測(cè)序（ChIP-seq）。另外，還出現(xiàn)了大量生物信息學(xué)預(yù)測(cè)技術(shù)。
　　 目前把基于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)統(tǒng)稱為濕實(shí)驗(yàn)（wet experiment），把基于生物信息學(xué)的

3、技術(shù)統(tǒng)稱為干實(shí)驗(yàn)（dry experiment，insilico experiment）。大量新穎的研究表明，要在全基因組范圍鑒定轉(zhuǎn)錄因子的TFBS及靶基因，必須將干濕實(shí)驗(yàn)技術(shù)有機(jī)結(jié)合。為此，本論文展開了這一方面的研究。
　　 本研究希望建立一種“濕實(shí)驗(yàn)→實(shí)驗(yàn)→濕實(shí)驗(yàn)”緊密結(jié)合的研究思路，快速高效鑒定一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的TFBS及靶基因，進(jìn)而構(gòu)建一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子控制的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究希望通過具體的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)這一思路是可行的，

4、是有效的。
　　 本論文首先設(shè)計(jì)出“濕實(shí)驗(yàn)→干實(shí)驗(yàn)→濕實(shí)驗(yàn)”的基本思想，即首先以濕實(shí)驗(yàn)手段獲得一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與大量人工設(shè)計(jì)DNA結(jié)合序列的結(jié)合特異性及親合性數(shù)據(jù)，篩選出所有能夠與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列；然后以干實(shí)驗(yàn)手段掃描人全基因組，定位這些序列在基因組中的分布，將它們推定為轉(zhuǎn)錄因子在基因組中的假定結(jié)合位點(diǎn)（putative binding sites，PBSs），并依據(jù)這些位點(diǎn)提取附近的基因，將這些基因推定為轉(zhuǎn)錄因子在基因組中

5、的假定靶基因（putative targetgenes，PTGs）；最后，以此為藍(lán)圖，再以濕實(shí)驗(yàn)手段快速驗(yàn)證這些假定結(jié)合位點(diǎn)及假定靶基因是否是轉(zhuǎn)錄因子的功能性（functional）結(jié)合位點(diǎn)及靶基因。其中第一次濕實(shí)驗(yàn)手段是dsDNA微陣列芯片，第二次濕實(shí)驗(yàn)手段主要是染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immuno-precipitation，CHIP）、PCR等。
　　 其次以著名的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB為研究對(duì)象，用單堿基突變ds

6、DNA微陣列芯片研究了NF-κB對(duì)所有單堿基突變DNA序列的結(jié)合，篩選出具有較高親合性的10個(gè)序列（GGGACTTTCC、GGGACTTCCC、GGGATITTCC、GGGAATTTCC、GGGAGTTTCC、GGGGCTTTCC、GGGTCTTTCC、GGGACTTTAC、GGGACTGTCC、GGGACTTTTC）；在本論文的干實(shí)驗(yàn)部分，對(duì)人基因組進(jìn)行了這10個(gè)序列的全基因組掃描，定位了這些序列的分布，發(fā)現(xiàn)這些序列在基因組中確有分布

7、，并且大量位于已知基因附近（上游、下游、內(nèi)部），因此將這些位點(diǎn)預(yù)測(cè)為NF-κB的假定結(jié)合位點(diǎn)，將與之聯(lián)系的基因預(yù)測(cè)為NF-κB的假定靶基因；掃描共得到42017個(gè)靶點(diǎn)，其中22170個(gè)靶點(diǎn)10kb內(nèi)有基因，被預(yù)測(cè)為PBSs，相應(yīng)的預(yù)測(cè)到9869個(gè)PTGs；通過文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)在PTGs中有135個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究鑒定的NF-κB靶基因。對(duì)PBSs在基因組中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)有11％的位點(diǎn)在基因5’端10kb內(nèi)（其中0-1kb內(nèi)1％，1-5

8、kb內(nèi)5％，5-10kb內(nèi)5％），27％的位點(diǎn)在基因內(nèi)部（其中第一內(nèi)含子內(nèi)10％，其他內(nèi)含子內(nèi)24％，外顯子內(nèi)3％），10％的位點(diǎn)在基因的3’端10kb內(nèi)，42％的位點(diǎn)在基因10kb外；這些分布特征與ChIP-chip等實(shí)驗(yàn)研究取得的結(jié)果相似。對(duì)PBSs和PTGs的染色體分布分析發(fā)現(xiàn)，兩者都有成簇分布的現(xiàn)象。對(duì)PTGs進(jìn)行功能聚類分析，并與文獻(xiàn)報(bào)道的確證靶基因的GO聚類分析結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PTGs的33個(gè)聚類條目中，有8個(gè)條目與確證靶

9、基因組的聚類條目重疊。干實(shí)驗(yàn)部分的研究為進(jìn)一步大規(guī)模實(shí)驗(yàn)鑒定NF-κB的DNA結(jié)合靶點(diǎn)和靶基因提供了行動(dòng)藍(lán)圖。在濕實(shí)驗(yàn)部分，我們挑選了具有代表性的7個(gè)靶基因（TNIP1、IL-6、HFE、MIA、RARG、STAT1、LTBP1），對(duì)其相應(yīng)DNA靶點(diǎn)進(jìn)行了濕實(shí)驗(yàn)分析，采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)配合PCR技術(shù)驗(yàn)證了7個(gè)典型基因附近預(yù)測(cè)的DNA結(jié)合靶點(diǎn)，12個(gè)新預(yù)測(cè)DNA靶點(diǎn)中9個(gè)靶點(diǎn)與NF-κB結(jié)合，濕實(shí)驗(yàn)部分的研究不僅發(fā)現(xiàn)了新的NF-κBD